甘蓝夜蛾中两种不同类型几丁质脱乙酰基酶基因克隆及表达与研究.pdf

摘要 摘 要 昆虫蜕皮是一个复杂的生理过程，在这个过程中有多种酶、激素和受体分子参与其中。 本研究对在其中分解几丁质起到重要作用的几丁质脱乙酰基酶基因进行了初步研究。通过破 坏昆虫几丁质脱乙酰基酶合成或降解途径将对昆虫非常有害，在实际应用中使其成为害虫生 物防治的又一靶标。 几丁质(chitin)又称甲壳素、甲壳质等，是aN．乙酰．D．葡萄糖胺通过p．1，4糖苷键连接 而成的直链高分子化合物。在自然界中，几丁质存在于真菌及藻类的细胞壁、无脊椎动物的 外骨骼及表皮中，是自然界中仅次于纤维素的第二大可再生自然资源。研究证明，几丁质是 昆虫表皮和围食膜的重要组成成分，昆虫生长、发育的各个时期都需要一定量的几丁质。 几丁质脱乙酰基酶(chitin 真菌、酵母和昆虫中都发现CDA的存在，是几丁质降解酶系成员之一，能够催化几丁质中B-1， 4糖苷键连接的N．乙酰基葡糖胺的乙酰胺基的水解，可以将几丁质转化为壳聚糖，在是昆虫 几丁质代谢中一种关键酶，在昆虫的多种生理活动中发挥重要作用。 brassicae 本研究以甘蓝夜蛾Mamestra 5龄幼虫虫体为材料提取总RNA，利用RT-PCR 和RACE技术，分别扩增得到甘蓝夜蛾的2种不同几丁质脱乙酰基酶基因的eDNA序列。 其中一种CDA含有2036个碱基，包括一个1617个碱基的开放读码框，编码一个含539 个氨基酸的蛋白，分子量约为61．5KDa，我们定义其为eDNA l；．另一种CDA含有1312 个碱基，包括一个1173个碱基的开放阅读框，编码一个含390个氨基酸的蛋白，分子量约 2。eDNA 为44．1KDa，我们定义其为eDNA l推导的氨基酸序列具有几丁质脱乙酰基酶典 型的三个功能区，分别是几丁质结合区，催化区和低密度脂蛋白受体区，属于CDA第l I)的成员。eDNA 组(group 2推导的氨基酸序列只有几丁质催化区，属于CDA第5组(group V)的成员。利用RT-PCR进行该基因在mRNA水平上的表达表明几丁质脱乙酰基酶eDNA l在幼虫取食期的唾腺、中肠、脂肪体组织表达，在体壁和马氏管中不表达；eDNA2只在 幼虫期的中肠表达，在其他组织及时期都不表达。将eDNA l基因利用表达载体pET21b 进行原核表达，经异丙基．B．硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，获得分子量约61．5KDa的蛋白。获 得的基因eDNA序列已经登录GenBank并获得登录号，eDNA l登录号为HQ680620， eDNA 2登录号为HQ680621。 关键词甘蓝夜蛾；几丁质脱乙酰基酶；克隆；表达 Abstract Molecularand oftwodifferentchitin cloningexpression cDNA fromMamestrabrassicae deacetylase sequences Abstract Insect isa and moltingcomplicated enzymes，hormones physiologicalprocess，many receptors involveinthis isthecritical ofchitinin process．Chitindeacetylase，whichdegradingenzyme cuticleand