肝纤维化形成中MMP-1、TIMP-1表达益气软肝方保护作用实验与研究.pdf

I MP一1表达及益气 肝纤维化形成中MMP-1、T 软肝方保护作用的实验研究 博士研究生：段志军 指导教师：胡祥 教授 专业名称：中西医结合临床 摘 要 肝纤维化是慢性肝病重要的病理特征，也是肝损伤向肝硬化进展的关键阶段。 细胞外基质(ECM)合成与降解失衡、基质重构、问质型胶原成分I、III型胶原 等异常增多而沉积是肝纤维化的病理基础。基质金属蛋白酶(MMPs)是一类具有 zn“依赖性的内源性蛋白酶，可降解多种ECM成分，其特异性抑制剂一金属蛋白酶 组织抑制因子(TIMPs)可对该酶系活性产生抑制作用。慢性肝损伤时，主要参与降 III型胶原降解减少而沉积导致肝纤维化。对MMP-1、TIMP-l的动态研究有助于显 示它们的作用。中药为抗肝纤维化的手段之一。益气软肝方(PGSL)为大连市中医 医院的经验方剂。近40年来，共治疗3000余例慢性肝病患者，临床研究发现有一 定抗肝纤维化、预防肝硬化的作用。我国慢性肝病的主要原因是乙肝病毒感染，目 前还不能用乙肝病毒制备肝纤维化动物模型，有学者认为人血清白蛋白(HSA)所引 起的大鼠免疫性肝纤维化模型在形态特征及发生机理上与乙肝病毒导致的肝纤维 化相似。 本论文在上述研究基础上，应用HGA所致的大鼠免疫性肝纤维化模型，在肝 纤维化形成的不同时期同步测定肝组织MMP～1、TI泗一l蛋白和基因水平的表达， 旨在进一步了解MMP一1、TI仲一l在肝纤维化发生发展中的作用；观察PGSL对肝纤 维化的保护作用，并对其作用机制进行初步探讨，尤其是其抗肝纤维化作用是否与 MMP—l、TI咿一l的变化有关。 一．实验性免疫性肝纤维化形成中MMP-1、TIMP-1的表达及动态研究 动物模型制备按Blackwel 1方法稍加改进，予HSA致敏大鼠后再予尾静脉攻击 注射。在攻击注射0、2、4、6、8周后取肝。应用肝组织羟脯氮酸(HYP)的测定 不断注射逐渐升高，HE染色可见纤维组织增生逐渐加重，显示HSA所致的免疫性肝 纤维化逐步形成，提示是一很好观察肝纤维化发生、发展过程的模型。2．MMP—l在 正常肝组织有蛋白表达，在肝纤维化发生、发展过程中以及肝硬化阶段，其蛋白 表达没有显著性变化(P均O．05)；而在此过程中TI卿一1蛋白表达水平逐渐增加(自 4周始，与0周比较有统计学差别：P均O．叭)，到肝硬化阶段达到高峰(8周时， 其升高接近0周的4倍)。3．在肝纤维化形成的进展中，m伊一1mRNA表达无明显变化 别与0周比较，pO．01)。4．在肝纤维化发生发展中，～m俨一1／TIMP一1蛋白表达比值 逐渐降低，尤其是4周以后，分别与0周比较有显著差异(pO。01)。5．重新按肝 纤维化增生程度分组，随着肝纤维化程度的加重，TIMP一1的表达逐渐升 高，卿一l／TI冲一l比值逐渐减小。 二．PQSL对大鼠免疫性肝纤维化的保护和治疗作用 蛎509、炙甘草10ff组成。按人鼠用药比例换算配制。动物模型为HSA所致大鼠免 疫性肝纤维化模型，PGSL保护组与攻击阶段同时灌胃，治疗组在攻击阶段第5周开 始灌胃，2ml／只／次，每日两次。在攻击注射8周末取血取肝。生化全自动测定仪 法测定血清转移生长因子一B；(TGF-B。)的表达；HE染色观察肝纤维组织增生与分 布情况，观察成纤维细胞增生程度，并观察肝细胞及炎细胞的变化；VG染色观察I I 型胶原增生程度；嗜银染色观察II型胶原增生程度；免疫组化方法检测Q一平滑 肌肌动蛋白(Ⅱ一SMA)在肝组织中的表达；通过透射电镜观察汇管区、纤维间隔以 外肝细胞间的窦周梭形细胞，并通过扫描电镜观察肝细胞的变化。结果如下： 1．PGSL可以降低免疫性大鼠的死亡率，保护组的死亡数更低于治疗组。2．PGSL可 以保护肝细胞一降低血清转氨酶，光镜及电镜下显示减轻的肝细胞损伤。3．PGSL 可以降低纤维组织增生程度一降低血清HA、LN和肝组织HYP含量(P均0。01)，降 低大鼠肝脏成纤维细胞、I型及III型胶原增生程度。4．PGSL可以降低血清TGF— p，浓度。5．免疫组化染色可见a—s姒在一些梭形细胞中的表达，透射电镜