鼠抗人B7-H4单克隆抗体功能及研究可溶性B7-H4酶联检测试剂盒优化.pdf

鼠抗人B7-H4 单克隆抗体的制备及可溶性B7-H4 酶联检测试剂盒的研制 中文摘要 中文摘要 B7-H4 作为一种负性共刺激分子，它是近年来发现的B7 家族的新成员之一。 它可以通过抑制 T 细胞的增殖、活化和细胞因子的分泌来调节适应性免疫反应。 人类的B7-H4 属于Ⅰ型跨膜蛋白，与其他B7 家族成员相比，其胞外部分有20-30 ％ 的氨基酸同源性。B7-H4mRNA 普遍表达于人的淋巴组织和非淋巴组织，但B7-H4 蛋白在正常外周组织中仅微弱表达。而健康者新鲜分离的树突状细胞（DCs ）、单 核细胞和T 、B 淋巴细胞均无表达，但在体外经活化刺激因子作用后也呈微弱表达。 近年来的研究表明,人的肿瘤细胞如结肠，前列腺细胞以及肺癌和卵巢癌组织等呈 现B7-H4 的异常表达,提示在肿瘤微环境中，B7-H4 在肿瘤细胞逃避机体的免疫监 视和维持机体免疫耐受过程中发挥着重要作用。因此，B7-H4 有望成为癌症患者 的诊断、预后以及治疗的靶标分子之一。 本研究旨在通过Jurkat 细胞与非小细胞肺癌细胞株SPCA-1 共培养的方法，利 用本室已制备的鼠抗人B7-H4 单克隆抗体5G3 去封闭SPCA-1细胞上表达的B7-H4 分子，通过共培养，检测共培养后Jurkat 细胞的生物学特性的改变。 利用本实验室已制备的可溶性B7-H4 （sB7-H4 ）ELISA 试剂盒做进一步优化， 检测非小细胞肺癌患者血清中sB7-H4 分子的表达。 一、鼠抗人B7-H4 单克隆抗体的功能研究 【目的】体外模拟体内环境对共培养后Jurkat 细胞的生物学特性进行研究。 【方法】通过RT-PCR 和FCM 方法检测肺腺癌细胞株SPCA-1 上B7-H4 表达 水平，SPCA-1 细胞株与Jurkat 细胞共培养72h ，收集共培养后的Jurkat 细胞，通 过FCM 方法检测其细胞表面CD3 和CD69 分子表达变化，Jurkat 细胞的凋亡以及 用CCK8 方法检测其细胞增殖变化。 【结果】 SPCA-1 表达B7-H4 ，分子作用于Jurkat 细胞，致使Jurkat 细胞上 CD3、CD69 分子表达下调；发生凋亡作用；细胞增殖下降。 【结论】在非小细胞肺癌细胞株SPCA-1 中，B7-H4 分子能够负性调节T 细胞 介导的免疫应答，为研究B7-H4 分子在肿瘤免疫中的作用提供了理论基础。 I 中文摘要 鼠抗人B7-H4 单克隆抗体的制备及可溶性B7-H4 酶联检测试剂盒的研制 二、sB7-H4 酶联检测试剂盒优化并检测非小细胞患者血清中的sB7-H4 含量 【目的】优化人 sB7-H4 酶联检测试剂盒并检测非小细胞肺癌患者血清中 sB7-H4 含量。 【方法】以本室已研制的人sB7-H4 酶联检测试剂盒为基础，采用鼠抗人单抗 1F10 作为包埋抗体，以生物素(biotin)标记的鼠抗人单抗 8F10 和5G3 作为检测抗 体，对本室已建立的双抗体夹心sB7-H4 酶标检测方法进行优化，并对非小细胞肺 癌患者血清中的sB7-H4 含量进行检测。 【结果】成功优化了人sB7-H4 酶联检测试剂盒，检测抗体以0.4μg/ml 的8F10 和0.1μg/ml 的5G3 的组合灵敏度最高，检测下线可达0.25ng/ml 。用该优化后的试 剂盒检测的非小细胞肺癌患者血清中 sB7-H4( 10.53±2.96)μg/ml ，高于健康者 (9.088±2.43)μg/ml(p 0.05) ；TNM 分期Ⅲ/Ⅳ期 sB7-H4 水平为(10.80±3.45)μg/ml， 明显高于Ⅰ/ Ⅱ期(10.33±2.67)μg/ml(p 0.05) ；男性和女性 sB7-H4 水平相差不大 (p 0.05) ，分别为(10.61±2.61)μg/ml 和 （10.38±2.48）μg/ml；年龄大于50 岁和小于 等于 50 岁的 sB7-H4 水平无显著差异(p 0.05) ，分别为(10.26±2.54)μg/ml 、 (10.41±2.65)μg/ml；术前sB7-H4 平(10.75±2.72)