微流控芯片平台构建与在肺癌细胞化疗耐药及研究中应用.pdfVIP

微流控芯片平台的构建及其在肺癌细胞 化疗耐药研究中的应用 博士研究生： 张黎川 指导教师： 王琪教授 专业名称： 内科学 摘要 背景： 微流控芯片实验室又称芯片实验室(Lab．011．Chip)或微流控芯片 (Microfluidicchip)，与传统实验平台相比，它具有集成度高、成本低、灵敏度高、 试剂消耗少和检测时间短等优点。近年来，微流控芯片技术得到迅速发展，由于 芯片通道的大小与细胞的微小尺寸相适应，因此微流控芯片已经成为进行细胞功 能研究的重要平台。 肺癌细胞对化疗药物的耐药始终是肺癌治疗的主要障碍。肿瘤的耐药机制十 分复杂，主要与肿瘤细胞基因的特异性有关，也与肿瘤细胞生存的微环境等密切 相关。其中与肿瘤特异性因素有关的细胞内耐药相关蛋白的作用一直是肿瘤耐药 性研究的热点。这些蛋白中比较有代表性的是P糖蛋白(P—gp)和谷胱甘肽一巯基． 转移酶7c(glutathione 达是肿瘤细胞产生多药耐药的重要因素。除了与这些肿瘤特异性因素有关外，肿 瘤细胞生存的微环境也是导致肿瘤细胞产生耐药的重要原因。研究发现，肿瘤细 胞缺氧的微环境条件可以诱导具有保护作用的葡萄糖调节蛋白(GRPs)的产生， 肺癌耐药关系的研究目前报道较少，本研究小组曾采用传统实验平台方法对以上 几种蛋白与肺癌细胞化疗耐药的相关性进行了分析与探讨，但是由于传统平台的 方法步骤繁琐，实验耗时、耗材较多，灵敏度欠佳。因此，在本研究中我们采用 微流控芯片这一新兴的技术平台，目的是用低耗材、集成化、更快捷、更灵敏的 方法进行肺癌细胞的化疗耐药性研究，本研究内容分为四个部分。 研究内容： 1．微流控芯片检测平台的构建。 选取PDMS为芯片材料，制作含有不同形状及尺寸规格的芯片培养池，用不 同浓度的鼠尾胶原溶液对芯片通道进行表面处理，筛选出最利于细胞生长的芯片 通道条件。设计不同的芯片通道组合，选出最合理的利于实验操作及实现研究目 的单元组合。分别构建两个不同通道组合的芯片体系用于不同介质条件下的细胞 培养及肺癌细胞化疗耐药性研究。 2．微流控芯片平台中的细胞培养及药物干预研究。 动介质下的SPCAl细胞培养，然后显微镜下动态观察不同体系中细胞的生长状态。 在细胞处于良好生长状态的前提下，分别进行不同芯片体系中细胞分组及药物干 预，以实现不同的对照实验条件。 3．基于微流控芯片平台的肺癌细胞耐药性检测及分析。细胞培养及分组药物 干预后，在用于静态介质细胞培养的芯片体系中，用免疫荧光细胞化学的方法检 一步证明它们的表达水平；PI染色方法确定细胞在化疗药物作用下的生存率。在用 于流动介质细胞培养的芯片体系中，同样采用免疫荧光细胞化学的方法测定细胞 生存率。根据两种体系中细胞耐药相关蛋白的表达及细胞在化疗药物作用下的生 4．微流控芯片平台与传统实验平台在肺癌耐药性研究中的比较。 将两种平台实验进行试剂消耗、操作过程及检测灵敏度等方面进行比较。同 样，对微流控芯片检测平台中分别用于静态及流动介质细胞培养的体系之间在细 胞培养过程及集成化程度分方面进行了比较。 结果： 1．微流控芯片检测平台的构建。 根据通道条件及芯片设计组合的筛选结果，分别构建了1)多通道平行组合芯 片体系，用于静态介质下两种肺癌细胞SPCAl及NCI．H-460的平行培养及肺癌细胞 化疗耐药性研究的对照实验。2)含有微阀结构及注射泵驱动功能的微流控芯片体 系，用于流动介质下SPCAl细胞培养及P．gp和GST-n表达与肺癌细胞化疗耐药性研 究。该体系中以注射泵驱动芯片通道内的液体形成流动介质下的细胞培养条件，以 模拟人体生理条件下细胞生长的动态微环境。在含对称U型侧通道的芯片上以普通 小夹代替微阀结构达到流体可控的目的，形成平行对照实验条件。 2．微流控芯片检测平台中的细胞培养及药物干预研究。 在两个不同芯片体系中细胞培养结果显示，无论在静态介质和流动介质条件 下，细胞均贴壁及生长良好，但相比之下，流动介质下细胞状态更佳，存活时间 也相对更长。将各体系中细胞进行分组(实验组与对照组)，两种培养条件下的 实验组细胞分别进行了相应的在线药物干预处理。在用于静态介质细胞培养的芯