加味补肝散含药血清对肝细胞损伤线粒体能量代谢影响.pdfVIP

中文摘要 目的： benzodiazepine 代谢为主线，从“疗效一机制一靶点力不同层次，从肝细胞的功能、凋亡率， 线粒体膜电位、胞内ca2+浓度、线粒体调节蛋白PBR浓度等不同角度，主 要研究在乙型肝炎肝硬化患者血清影响下肝细胞LO：的损伤情况以及加味 补肝散含药血清的保护作用，系统阐述其线粒体途径的作用机制，为中药 复方加味补肝散的临床应用及研究开发提供实验数据和理论依据。 方法： 1．运用细胞培养技术体外传代培养人正常肝细胞Lo：，设定含有不同 血清比例的3组培养液模拟乙型肝炎肝硬化患者机体内环境，乙型肝炎肝 bovin serum， 硬化患者血清(以下简称“患者血清力)和胎牛血清(fetal 后分别通过MTT法检测肝细胞增殖情况筛选适宜的造模血清浓度。 ．2．确定造模血清浓度后，先将实验分为空白组(不合肝细胞)、正常 组和模型组，共3个组。正常组用含10％FBS的培养液培养，空白组、模 型组均用含10％患者血清和5％FBS的培养液培养。24h后，光镜观察肝细 胞Lo：形态学改变、定性检测乙型肝炎病毒血清学标志物(HBV_M)、定量 检测肝细胞功能，从细胞形态、病原和功能等角度评价肝细胞损伤的体外 实验模型。 3．模型确定后，再将实验分为正常组、模型组、对照组(还原型谷胱 00 甘肽，GSH，浓度为1pg／m1)、加味补肝散含药血清高剂量组(浓度为 2o％)、中剂量组(浓度为10％)、低剂量组(浓度为5％)，共6个组。24h 和48h后分别观察、检测相关指标：(一)光镜观察各组肝细胞LO：的形 态改变；(二)全自动生化分析仪检测各组肝细胞功能；(三)流式细胞仪 检测各组肝细胞凋亡率；(四)流式细胞仪检测各组肝细胞线粒体膜电位 和胞内Ca2+浓度；(五)ELISA法检测线粒体膜PBR浓度水平。 结果： 1．筛选出适宜造模血清比例：24h后，除正常组外，3个测试组肝细 胞形态均出现不同程度的改变：数量减少、体积增大、细胞碎裂、核仁缩 小。含10％患者血清和5％FBS组最明显，且改变随着患者血清浓度的增高 和作用时间的延长更加明显。MTT法检测结果显示，12h和24h后，该组 肝细胞吸光值明显低于正常组(只o．05)，增殖明显受到抑制，提示该组 血清比例适宜造模。 2．体外实验模型成功：24h后，模型组肝细胞数量减少，部分细胞脱 壁，细胞体积肿胀，形态出现改变：颜色变深，颗粒粗糙，核固缩，染色 质凝集等；HBsAg阳性率明显高于正常组，差异有显著统计学意义 差异有显著统计学意义(P(0．05)。提示模型能够模拟肝细胞在患者体内的 损伤情况。 3．对肝功能的影响： 24h和48h后，模型组肝细胞功能ALT、AST、 TBi 1等指标均高于正常组，差异有统计学意义(尺o．05)，GSH组以及加味 补肝散含药血清高、中、低剂量组ALT、AST、TBi1等指标均低于模型组， 差异有统计学意义(只0．05)。 4．对肝细胞凋亡率的影响：模型组肝细胞凋亡率高于正常组，差异有 统计学意义(P0．05)，GSH组以及加味补肝散含药血清高、中、低剂量组 肝细胞凋亡率均低于模型组，差异有统计学意义(尺o．05)。 5．对线粒体膜电位的影响：模型组肝细胞线粒体膜电位Rhl23荧光 值低于正常组，差异有显著统计学意义(伏o．01)，GSH组以及加味补肝散 含药血清高、中、低剂量组肝细胞线粒体膜电位Rhl23荧光值均高于模型 组，差异有统计学意义(尺0．05，尺0．01)。 · 6．对肝细胞胞内ca2+浓度的影响：模型组肝细胞ca2+浓度高于正常组， 差异有显著统计学意义(尺0．01)。GSH组以及加味补肝散含药血清高、中、 低剂量组ca2+浓度均低于模型组，差异有统计学意义(只o．05，尺o．01)。 7．对线粒体调控蛋白PBR浓度的影响：模型组PBR浓度高于正常组， 差异有统计学意义(只o．05)。GSH组以及加味补肝散含药血清高、中剂量 组PBR浓度均低于模型组，差异有统计学意义(尺o．05)。 一 结论： 1．用含10／0患者血清和5％FBS的培养液培养人正常肝细胞LO：，能够 抑制肝