《人A组轮状病毒结构蛋白VP7原核表达及其卵黄抗体效价的研究.》.pdfVIP

第27卷第3期 四川理工学院学报 (自然科学版) Vo1．27 No．3 文章编号：1673—1549(2014)03-0015-05 DOI：10，11863／j．suse．2014．03．04 人A组轮状病毒结构蛋 白VP7原核表达及 其卵黄抗体效价的研究 李丙超h，李再新 ，胡卫东 ，黄永生 ，唐文才h，张 智 (1．四川理工学院a．生物工程学院；b．化学与制药工程学院，四川 自贡643000； 2．富顺县人民医院，四川 自贡643000) 摘 要：为获得人A组轮状病毒重组结构蛋 白VP7及其高效价的卵黄抗体，使用PCR技术扩增 VP7DNA片段并将其克隆到原核表达载体pET28a上形成重组质粒pET28a—VP7。将重组质粒转化基 因工程菌E．CoilBL21(DE3)，用0．5mMIPTG诱导VP7重组蛋白的表达。通过包涵体纯化和蛋白复性 后，将VP7重组蛋白与弗氏佐剂混匀免疫产蛋鸡，收集鸡蛋。用水稀释 一盐析法纯化卵黄抗体 IgY。进 一 步应用SDS—PAGE、ELISA和点杂交技术，分析该卵黄抗体的纯度、效价和特异性。结果表明在基因 工程菌E．coliBL21(DE3)中能够实现Vfy7重组抗原的表达，将重组抗原VP7免疫产蛋鸡，提取纯化得到 滴度为 1：100000的抗VP7卵黄抗体，且特异性的识别野生型A组轮状病毒。 关键词：人A组轮状病毒；VP7；原核表达；包涵体；免疫；卵黄抗体 中图分类号：R113；R272．5 文献标志码 ：A 引 言 药物研发奠定基础。 l 材料和方法 轮状病毒属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，其中人A 组轮状病毒是引起婴幼儿急性 胃肠炎的最主要病原体， 1．1 材料与试剂 可造成严重脱水甚至危及生命。全球每年约有 1．4亿 基因工程菌株 E．coliDH5oL和 E．coliBL21(DE3)， 人发生轮状病毒腹泻，并导致大约 80万儿童死亡…。 以及原核表达质粒 pET28a(+)均为四川理工学院化学 人A组轮状病毒为双链 RNA病毒，含有 11个分节段的 制药实验室保存。含野生型 A组轮状病毒 (诊断为 G4 基因片段，共有 6种结构蛋 白(VP1，VP2，VP3，VP4， 血清型)，粪便样品和对照样品均 由自贡某医院提供。 VP6，Vfy7)和 5种非结构蛋 白(NSPI，NSP2，NSP3，NSP4， T4DNA连接酶购于NEB公司；EXTaqDNA聚合酶、限 NSPS) 。其中轮状病毒 VP7蛋白是该病毒的一个重 制性核酸内切酶EcoR，和Xho，等购于TaKaRa公司； 要的结构蛋白，在激发机体体液免疫产生特异性抗体方 DNA片段回收试剂盒和质粒抽提试剂盒购于北京博大 面发挥极为重要的作用 。为此，本研究拟通过原核表 泰克公司；HRP标记的兔抗鸡 IgY、弗氏完全佐剂、弗氏 达获得轮状病毒VP7的重组抗原 ，将纯化的重组抗原免 不完全佐购于 Sigma公司；Bradford蛋白定量试剂盒购 疫产蛋鸡，进一步应用水稀释 一盐析法提取分离高效价 于Bio—rad公司；其余试剂均为国产分析纯。含VP7全 含抗Vfy7的卵黄抗体，为轮状病毒感染性腹泻的靶 向性 长序列的模板由北京中科院微生物研究所陈晓英老师 收稿 日期：2014-02-10 基金项 目i新疆生物资源基因工程重点实验室开放课题 (XJDX0201．2014-01)；四川省战略新兴产业资助项 目(10-046-04一Z11)；四川省教 育厅项 目(12ZA088) 作者简介：李丙超(1988一)，男，河北廊坊人，硕士生，主要从事发酵工程方面的研究，(E ia1)946989352@qq．conl 16