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基因克隆及常见问题分析  基因克隆及常见问题分析 TIANGEN BIOTECH CO.,LTD DNA 克隆的目的 DNA 克隆的目的 ÿ 目的基因的序列测定及筛选 目的基因的序列测定及筛选 ÿ 增加 目的基因的拷贝，降低后续实验的难度 增加 目的基因的拷贝，降低后续实验的难度 ÿ 研究基因表达 ÿ研究基因表达 ÿ 其他 （如点突变、SNP等） ÿ其他 （如点突变、 SNP等  ） 克隆的过程 克隆的过程 网上检索 网上检索 引物设计  引物设计 扩增产物 与克隆载体 扩增产物 与克隆载体 PCR扩增 PCR 扩增 纯化 连接 纯化 连接 转化、培养 DNA提取  转化、培养 DNA 提取 感受态  感受态 E.coli制备 E.coli 制备 PCR或 生物信息学 PCR 或 重组克隆 生物信息学 重组克隆 测序检测 质粒提取 测序检测 质粒提取 分析等 酶切鉴定 筛选  分析等 酶切鉴定 筛选 连接克隆分类 （以PCR产物克隆为例） 连接克隆 分类 （ 以 PCR 产物克隆为例） q 酶切连接克隆 q 酶切连接克隆 PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后 PCR 引物设计时引入载体上的酶切位点， PCR 产物经双酶切后 定向克隆到目的载体上。这种方法的优点是定向连接克隆，筛选 定向克隆到目的载体上。这种方法的优点是 定向连接 克隆，筛选 方便。缺点则是PCR产物的酶切和判断比较困难，另外酶切连接过 方便。缺点则是 PCR 产物的酶切和判断比较困难，另外酶切连接过 程本身也相当地费时费力。 程本身也相当地费时费力。 q TA克隆 q TA 克隆 应用最广的非定向克隆方法。PCR产物带有A末端，可以用带 应用最广的 非定向 克隆方法。 PCR 产物带有 A 末端，可以用带 有T末端突出的T载体直接连接。方法简便，不需酶切，对引物设 有 T 末端突出的 T 载体直接连接。方法简便，不需酶切，对引物设 计也没有要求。 计也没有要求。 DNA 克隆的几大要素 DNA 克隆