DNA重组技术的基本工具---上课用..pptVIP

基础理论和技术发展催生了基因工程 科技探索之路 后期基础理论 沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。 基础理论和技术发展催生了基因工程 科技探索之路 后期基础理论 梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保留复制 基础理论和技术发展催生了基因工程 科技探索之路 后期基础理论 克里克等提出中心法则 DNA RNA 蛋白质 转录 翻译 逆转录 复制 基础理论和技术发展催生了基因工程 科技探索之路 后期基础理论 1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码，1966年霍拉纳用实验加以证明。 基础理论和技术发展催生了基因工程 科技探索之路 1)基因转移载体的发现 2)工具酶的发现 3)DNA合成和测序技术的发明 4) DNA体外重组的实现 5)重组DNA表达实验的成功 6)第一例转基因动物问世 7)PCR技术的发明 为什么限制酶不能将自己的DNA分子剪切掉？ 1、DNA分子不含限制酶的识别切割序列； 2、通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使了限制酶不能切开。 结合图片来说一说什么是基因工程？ 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术或基因拼接技术。 一、基因工程的概念： 又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。 原理 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程 结果 基因重组 生物体外 基因/DNA 分子水平 剪切→拼接→导入→表达 人类需要的基因产物 问题探讨： 　　　苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。 　　　让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。 想一想需要做哪些关键工作？ 普通棉花　　抗虫棉 1.为什么限制酶和DNA连接酶在微生物中能够分离到,而高等植物和动物中没有? 提示：从噬菌体侵染细菌中获得灵感 原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是生物在长期的进化过程中形成了完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。 限制性核酸内切酶就是细菌的防御性工具，当外源DNA侵入时，限制性核酸内切酶会将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。 所以，限制性核酸内切酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而保护自身的作用。 如何切割DNA分子呢？ DNA分子 磷酸二酯键 切割DNA分子实质是断开两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 一、限制性核酸内切酶—“分子手术刀” A A T T G C C T T A A G 磷酸二酯键 磷酸二酯键 一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀” 1、来源——主要是从原核生物中分离纯化而来 （流感嗜血杆菌） 2、功能——一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子。 限制酶的识别序列： 中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称、重复排列的 　 EcoRⅠ 黏性末端　　　　 黏性末端 Go back 　 EcoRⅠ 黏性末端　　　　 黏性末端 Go back 重复演示 什么叫黏性末端？ 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。 SmaⅠ 平末端　　　平末端 要想获得目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？ 要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。 要把目的基因插入运载体的前提是什么 必须用同一种限制酶来切割目的基因和运载体。 思考? CTTCATG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGGATT GGCATCTTAA AATTCCGTAG 练习使用EcoRI 剪切目的基因 CTTCATG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGGATT GGCATCTTAA AATTCCGTAG 目的基因 黏性末端 二、“分子缝合针” —— DNA连接酶 ①作用: 把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来. ②作用原理： 催化磷酸二酯键形成 可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来， E·coli DNA连接酶　　　　　　　　或T4DNA连接酶 即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键