DNA重组表达技术原理及方法..pptxVIP

方泽民;DNA重组表达;目的不同 获得大量DNA copy 获取DNA信息 获得目的蛋白 使用载体不同 克隆载体 表达载体 ;DNA重组表达流程;真核生物 Genomic DNA cDNA mRNA 原核生物 Genomic DNA cDNA mRNA ;密码子偏好性;7;8;9;MKLNRRDFVRLAAMSVFAQPVLAALPSVEEARRFRLELRPEQRNWIPQSEMPVDLWGLSDSQLTLRQGEPVEIEVVNQLPEPTTLHWHGLRIENAMDGVSGLTQEPIPPGGTFTYRFTPEDAGTFWAHSHHKTYEQLARGLYLPVVVEEKIASDTDQDILMVIDDWRVNNEGQLDSESLGSLHEWAHGGRLGNFLTINKEVQPSFTVKAGSRVRLRLLNTANARIFAVDLPEVPAWILAKDGQPLANLMQVTETVVMAPAERYDLILDIPRDAEGQLSVTMPTDRAPIEMAYLQVEGLHESERVQSPDPLPANPIEEISPDQIPDHKLVLDMTGGAMGSMTQAVYNGQQMSMQELIQHRQIWAFNGVANRPLDPLLEARSGELVEIEIINNTGWAHGMHLHGHHFKADLARYNPDLWHDTLLMDSGESSRIRFIAGKPGSWLLHCHMIEHQAAGMVSWIKVIG;3. 合适载体和宿主的选择;3.2 大肠杆菌表达外源基因的劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素;3.3 甲醇酵母表达系统的优缺点;按蛋白质类型分 单纯表达: pJLA系列, 用NcoI/NdeI导入AUG的载体 融合表达: 融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc 分泌表达: pel/ompT分泌肽; pJLA50X系列; pcDNAII; etc pET系列 (T7 promoter, Novagen公司) pQE系列 (T5 promoter, Qiagen公司) pMAL系列 (周质表达, BioLabs公司) pGEX系列 (GST融合表达, Pharmacia公司) pBAD系列 (Arabinose诱导型) pTYB系列 (CBD融合, 可以自我切割, BioLabs) ;Protein A GST（glutathione S-transferase） CBD (chitin-binding domain, BioLabs; cellulose-binding domain, Novagen) calmodulin-binding domain, Stratagene) MBP (maltose-binding protein) GFP (green fluorescence protein) Thioredoxin **帮助二硫键形成 Dsb (periplasma enzyme DsbA, DsbC) ** 二硫键的形成 SUMO (small ubiquitin-related modifier) KSI (ketosteroid isomerase) 基本上全部沉淀;3.5 甲醇酵母系统胞内表达载体;信号肽：PHO1;信号肽：MFα;信号肽：MFα;3.6 选择表达系统;;外源基因在大肠杆菌中的表达;P tac = 3 P trp = 11 P lac;启动子;;;Lac 表达系统 lac UV5 突变体 Plac UV5 突变体能够在没有 CAP 存在的情形下非常有效的起始 转录，受它控制的基因在转录水平上只受 lacI 的调控，因此用它 构建的表达载体在使用时比野生型 Plac 更易操作。;Lac 表达系统 负调节因子 lac I 在无诱导物情形下， lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动 子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。; 转录调控机理 色氨酸启动子 Ptrp 受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底