利用基因表达谱芯片筛选胃癌及转移相关差异表达基因的研究.pdf

·中文论著摘要· 利用基因表达谱芯片筛选胃癌及转移相关差异 表达基因的研究 目 的 胃癌是严重威胁人类健康的主要恶性肿瘤，广泛侵袭和重要脏器转移是绝大 多数胃癌患者的致死原因，如何解决胃癌及其转移早期诊断和防治的难题，已成 为提高胃癌患者5年生存率所面对的最大挑战。近年来人们已经认识到肿瘤及其 转移是多基因多步骤相互作用连续发展的过程，对肿瘤进行整体全面的包括发展 动态的研究是最终解决肿瘤防治的根本途径。基因表达谱芯片为研究胃癌及转移 相关基因表达提供了理想的技术支持，通过对来源不同个体、不同组织、不同刺 激条件下的组织细胞内表达情况的对比分析，筛选出具有个体特异性、组织特异 性、刺激特异性差异表达基因群，并对基因群的变化特征和规律进行描述。 本研究应用含有14784条人类全长基因的cDNA表达谱芯片，以临床切除的胃 癌和正常胃粘膜组织、胃原发癌和转移癌组织标本为研究对象，筛选胃癌、淋巴 结转移和肝转移相关差异表达基因，进一步应用RT-PCR、免疫组化和Western印 记分析验证部分差异表达基因在胃癌、淋巴结转移组织中的表达，从分子水平阐 释胃癌及其转移的机制，对有效防治胃癌、提高胃癌患者长期生存率具有重要的 指导意义。 实验方法 1、标本收集与临床病理资料 选取大连医科大学附属第一医院普外科手术切除、病理检查证实的胃癌6例， 其中4例伴有淋巴结转移，l例伴有肝转移，每例于标本离体后立即取胃原发癌组 织、配对的正常胃粘膜及转移灶癌组织，入液氮冷冻保存备用。所选用病例术前 均未行放疗和化疗，且经组织学检查证实。 2、cDNA微阵列芯片制备 芯片采用上海生物芯片有限公司提供的人14KcDNA表达谱芯片，为监控芯片 杂交数据的可靠性，设定阳性对照为看家基因(10个)：阴性对照为细菌基因(6 个)：空白对照为点样液。人14KcDNA表达谱芯片基因总数14784个，矩阵点数为 18点×18点×48(亚矩阵)，点问距230pm。 3、mRNA抽提 按Trizol一步法分别抽提胃癌组织、正常胃粘膜和淋巴结转移、肝转移组织 总RNA，采用QIAGEN RneasyKit进一步纯化总RNA，应用琼脂糖凝胶电泳判断 28S和18S的亮度比例评价总RNA的质量，分离mRNA。 4、标记与杂交 Cy3一dUTP标记不同组织的mRNA。将含混合探针的杂交液与芯片变性后，将杂交液 滴于芯片点样区，用盖玻片覆盖，置于杂交舱中，用Parafilm密封，放入42。C中 温水浴杂交16h。 5、结果分析 采用激光共聚焦荧光扫描仪扫描芯片，用OuantArray8分析软件读取数据，得 比值的自然对数绝对值2或O．5，判断为差异表达基因。 6、RT—PCR实验验证部分表达差异基因 取胃癌组织、淋巴结转移组织的RNA在常规条件下从引物开始反转录，PCR 扩增，检测筛选出的差异表达基因在胃癌组织和淋巴结转移组织中的表达，对基 因芯片结果进行验证。 7、验证差异表达基因EphB4的蛋白水平 采用免疫组化和Western印记方法对筛选出差异表达基因Ephb4在正常胃粘 膜、不同分期的胃癌和淋巴结转移组织中蛋白表达进行分析，同时探讨EphB4表达 与胃癌临床病理因素的关系。 2 8、统计学分析 采用SPSSIO．0软件，计数资料采用x2检验，四格表的确切概率法，PO．05有统 计学意义。 结 果 l、RNA质量控制 分别提取胃癌组织和癌旁J下常组织中总RNA的含量在50ug～lOOug之间，琼脂 度和完整性较好。 2、差异表达基因分析 本研究测定了胃癌的全基因序列，筛选出胃癌及转移相关差异表达基因。与正 常胃粘膜组织相比，6例胃癌组织中共检出40个差异表达基因，21条基因出现显著 表达上调，19条基因出现显著表达下调。与胃癌组织相比，在4例淋巴结转移组织 中共检出46个差异表达基因，18条基因出现显著表达上调，28条基因出现显著表 达下调。在肝转移癌组织中共检出178个差异表达基因，114条基因出现显著表达 上调，64条基因出现显著表达