腺苷酸环化酶ⅢAC3在非神经细胞中定位研究.pdf

Classified Index: CODE: 10075 U ．D ．C ．: NO: A Dissertation for the Degree of M ． Science Study of Type Ⅲ Adenylate Cyclase (AC3) Locates on Non-neuronal Cells ． Candidate: Haojiangye Supervisor: Prof ．Wang zhenshan Academic Degree Applied for: Master of Science Specialty: Biochemistry and Molecular Biology University: Hebei University Date of Oral Examination: June ， 2014 摘 要 摘 要 cAMP 作为细胞内最重要的第二信使之一，调节细胞的许多生物学功能，包括卵子 发生、胚胎发育、幼体发育、荷尔蒙分泌、糖代谢、平滑肌收缩、心脏收缩、嗅觉、学 习以及记忆等。 腺苷酸环化酶(AC)是 cAMP 信号转导通路的重要组分，其主要作用是催化 ATP 生 成 cAMP 。AC3 是 AC 家族中的第 3 个成员，它是已分离、鉴定的其中 9 个膜整合蛋白 之一。研究发现 AC3 不仅表达于小鼠海马区、下丘脑和嗅觉表皮组织等部位的神经细 胞纤毛，还广泛存在于脊髓、肾上腺髓质和皮质、心房肌、主动脉平滑肌、肺、肾、胰 岛、睾丸和卵巢等多种组织器官，并与多种生理功能密切相关。 纤毛是突出于真核细胞表面的、以微管为结构基础的“毛发状”细胞器，它能感知 细胞外机械和化学信号刺激。纤毛分为两大类：运动纤毛和不动纤毛，不动纤毛即初级 纤毛，它普遍存在于多种生物的各种类型细胞表面。初级纤毛上含有多种特异受体、离 子通道蛋白和信号转导蛋白等。近年发现初级纤毛参与了细胞内信号传导等多种细胞生 物学过程，对动物的发育调控及维持各个组织器官正常生理功能具有重要作用。 尽管 AC3 表达在多种非神经细胞中并具有重要的生理功能，但它在这些非神经细 胞的表达部位，尚待确定。本研究旨在明确 AC3 在这些非神经细胞中的表达情况以及 表达部位。 本论文以大鼠嗜铬细胞瘤 PC12 、人神经胶质瘤细胞U251 、小鼠肾内髓集合管上皮 细胞 IMCD3 、人肾上皮细胞293T 、骨髓基质干细胞BMSCs 、成骨细胞 OB、人宫颈癌 细胞 HeLa 和人肺癌细胞 A549 为研究材料。研究的内容主要分为 2 个部分： 第一部分通过 RT-PCR 技术对细胞的 AC3 基因 mRNA 表达水平进行半定量，PCR 产物 DNA 测序，所得序列用生物学软件DNAMAN6 ．0 分别将人和鼠的AC3 基因 cDNA 进行比对分析。 第二部分：运用细胞免疫荧光染色，对 PC12 、U251 、IMCD3 、293T 、OB 和 BMSC 以及A549 和 HeLa 细胞中 AC3 的表达部位进行确定。 研究结果如下： 1、以AC3 基因的特异性引物，扩增并检测 AC3 基因在相关细胞中有扩增产物，对 I 摘 要 PCR 产物测序并进行比对分析显示，这些细胞中均有 AC3 基因的内源性表达。 2 、免疫荧光染色结果显示PC12 和 U251 细胞株中均发现了阳性标记的 AC3 抗体， 并与纤毛标记抗体 Acetylated α-Tubulin 染色发生重叠。小鼠 IMCD3 细胞株和人肾组织 的293T 细胞中大多细胞具有初级纤毛亚结构，且 AC3 亚定位于该细胞的纤毛部位，在 这两