雪莲细胞培养及其二氢黄酮醇4还原酶DFR基因的分离克隆的研究.pdf

中文摘要 雪莲（Saussurea involucrata Kar et Kir ）是一类名贵中草药，主要药用活性 成分为黄酮类化合物。该文通过研究不同植物激素对雪莲愈伤组织诱导和分化 的影响，探索不同植物激素和培养时间对雪莲愈伤组织生长量和总黄酮含量的 影响，并分离了雪莲 DFR 基因片段，利用生物软件对 DFR 基因和蛋白质的结 构和功能进行分析、预测。为基于愈伤组织所进行的遗传转化提供参考数据。 主要研究结果如下： 1. 雪莲种子萌发 温度、培养基成分和渗透势显著影响雪莲种子的萌发，其中温度对雪莲种 子萌发影响极显著，20/10 ℃变温条件下种子萌发率最高；渗透势和培养基成分 对雪莲种子萌发影响显著，种子萌发的最适培养基为 1/2MS 。聚乙二醇（PEG ） 0 高于-0.9MPa 时，种子不能萌发。 2. 植物激素对雪莲愈伤组织诱导和分化的影响 植物激素对雪莲愈伤组织的诱导和分化影响显著。单因素诱导中，NAA 的 诱导效果显著优于其他激素，诱导效果：根叶柄叶片；NAA 与 6-BA 激素组 合诱导中，叶片与叶柄诱导率之间存在极显著性差异，而叶片与根，叶柄与根 的诱导率之间存在显著性差异，诱导效果：叶片 叶柄根。以叶片为外植体， 最佳诱导培养基为 MS+6-BA1.00mg/L+NAA2.00mg/L ；最佳出芽培养基为 MS+6-BA1.00mg/L+NAA0.20 mg/L ； 最 佳 生 根 培 养 基 为 1/2MS +NAA0.30mg/L+KT0.03mg/L 。 0 3. 雪莲愈伤组织黄酮类化合物的测定 研究继代培养基和培养时间对雪莲愈伤组织生长量、总黄酮含量和产量的 影响，结果表明：（1）继代培养基以MS+NAA 2.00mg/L+6-BA1.00mg/L 中愈伤 组织生长量和总黄酮产量最高；以 MS+NAA 4.00mg/L+6-BA2.00mg/L 中的愈伤 组织总黄酮含量最高；（2 ）愈伤组织生长量随继代培养时间的延长而增加，其 总黄酮含量不稳定，在继代培养第 30d 达到最高。 4. 雪莲 DFR 基因片段的分离克隆与序列分析 通过降落 PCR 与梯度 PCR 相结合的方法，分离得到雪莲 DFR 基因片段长 1464bp，分子量约为 44Kda 。分离得到的 DFR 基因片段与水母雪莲 DFR 基因 的DNA （EF672726 ）高度相似，具有同源性。序列分析预测可以看出，DFR基 因推导蛋白不存在卷曲螺旋结构，无信号肽，是一个跨膜的疏水性蛋白，高级 结构中含有 6个α-螺旋，3个 ß-片层。 关键词：雪莲；愈伤组织；植物激素；总黄酮；DFR基因；分离；克隆 Ⅰ Abstract Saussurea involucrata Kar.et Kir.is a traditional medicial plant that is well know for its richness in flavonoids. Supply of this plant mainly from its wild populations,but due to the rate of survive is extremely low and destroied unlawful by people,and now this valuable plant species is under an enormous pressure for survival.In order to solve this problem ,increase the flavonoids in Saussurea involucrata.An alternative way to produce the bioactive compounds would b