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抑制内皮祖细胞自噬对在血栓机化再通的实验研究（二） 中文摘要 抑制内皮祖细胞自噬对在血栓机化 再通的实验研究（二） 中文摘要 目的：应用适量自噬抑制剂3-MA （3- 甲基腺嘌呤）作用于内皮祖细胞（endothelial progenitor cells ，EPCs ）后，移植到大鼠深静脉血栓模型体内，探讨干预后的 EPCs 在血栓机化再通中的作用，进而为下肢深静脉血栓治疗提供一种新的思路和实验依 据。 方法：1.Ficoll 密度梯度离心法获取 SD 大鼠来源的骨髓单个核细胞（bone marrow-derived mononuclear cells ，BMMNCs ），经内皮祖细胞培养基（EGM-2MV ） 体外诱导、培养、扩增EPCs ，在倒置显微镜观察细胞形态学特征，MTT 法检测EPCs 增殖情况。采用内皮细胞系列标志：CD133 、CD34 免疫荧光技术及VEGFR-2 、vWF 免疫组化对其进行鉴定。利用三维培养实验证实EPC 具有形成血管能力。采用MTT 比色法测定各浓度3-MA 及对照组EPCs 增殖的作用。 2. 血栓模型建立：采用缩窄肾下段下腔静脉结合三氯化铁浸润破坏血管内膜方 法建立大鼠深静脉血栓模型，并饲养至 10 天，备移植用。动物随机分四组，经大鼠 股静脉穿刺注射移植液体。A 组(n=15) ：空白对照组，注射生理盐水；B 组（n=15 ） 6 EPCs 移植组，移植lml 含有 10 个EPCs 的细胞悬液；C 组(n=15) ：注射3-MA 稀释 液（5mmol/l ）；D 组(n=15) ：移植1ml 含有经5mol/l 3-MA 处理后的EPCs 的细胞悬 液。3 ．移植后分四个时间段 （0 天、7 天、14 天、28 天）取出血栓段下腔静脉及血 栓，应用免疫组织化学法检测各组血栓中新生血管及机化再通的情况。实时荧光定量 PCR 检测各组标本中VEGF ，bFGF ，MCP-1，Ang-1 mRNA 表达情况。4 ．采用SPSSl7 ．0 软件进行分析。 结果：1. 刚分离的骨髓单个核细胞(BMMNCs)大小不一，呈圆形，第3 天左右细胞 逐渐贴壁，细胞形态多样，呈梭形、卵圆形、纺锤形、三角形或不规则形，一周左右可 见细胞集落、细胞呈线状排列，第 10 天左右细胞呈典型鹅卵石样外观。细胞生长曲线 I 中文摘要 抑制内皮祖细胞自噬对在血栓机化再通的实验研究（二） 呈“S”形，EPCs 在培养的5~1 1 天时增殖较快，13 天后进入平台期，生长曲线呈典型“S’’ 形外观。贴壁细胞的CD34、VEGF、vWF、CD133 均表达阳性。成血管实验显示：EPCs 细胞间首尾相连，形成管腔样结构。MTT 显示，与对照组相比较，3-MA 在浓度5mmol/l 对于EPCs 的增殖有明显的促进作用。 2. 体外成功诱导培养了大鼠骨髓源性EPCs ；vWF 免疫组化显示D 组的血栓再通 毛细血管密度明显高于其他三组，D 、B 之间差异有统计学意义；A、C 组之间差异 无统计学意义；RT-PCR 结果显示A 、B 、C、D 组VEGF ，bFGF ，MCP-1，Ang-1 基 因均有表达，D 组较A、B 、C 组明显上调(P0 ．05) ；B 组较A、C 组表达上调（P0.05 ）； A 组与C 组之间差异无统计学意义。 结论：通过适度的自噬抑制，可促进EPCs 增殖，移植后血栓内血管的新生能力 明显增强，加快了血栓的机化和再通。 关键词： 内皮祖细胞 自噬 血栓 机化再通 作 者：蔡志新 指导教授：李晓强 本课题受国家自然科学基金资助