人胎儿角膜上皮细胞的体外培养和性质鉴定.pdf

摘 要 目的 建立人胎儿角膜上皮细胞体外原代培养和传代培养方法，优化人胎儿角膜上皮 细胞的培养体系，为构建组织工程角膜提供上皮种子细胞。 方法 一、 人胎儿角膜上皮原代和传代培养 1、原代培养 严格无菌操作获取人胎儿角膜片，采用组织块贴壁法(角膜缘部、中央部)、酶 消化法原代培养人胎儿角膜上皮细胞。 2、传代培养 角膜缘部的细胞生长融合达80％以上，不同稀释浓度的胰酶／EDTA消化液消化 传代分别接种于空板、小鼠3T3成纤维细胞饲养层、胎儿角膜基质细胞饲养层及HTK 饲养层，培养液分别采用D／F12、小鼠3T3成纤维细胞条件培养液、胎儿角膜基质 细胞条件培养液、HTK条件培养液。 二、人胎儿角膜上皮细胞培养体系的条件优化 l、三种条件培养液蛋白含量测定与细胞增殖检测 将收集的小鼠3T3成纤维细胞条件培养液、胎儿角膜基质细胞条件培养液、HTK 条件培养液使用BCA蛋白定量试剂盒测定样品的蛋白含量。 设D／F12为对照组，MTT法检测3T3条件培养液、胎儿角膜基质细胞条件培养 液、HTK条件培养液对人角膜上皮细胞系的增殖能力。 2、牛角膜细胞破碎液蛋白含量测定与细胞增殖检测 将收集的牛角膜上皮细胞、基质细胞及内皮