景建洲DNA序列测定.ppt

DNA序列测定 末端终止法--待测单链DNA 模板 引物 四种dNTP(其中一种用32P/35S标记) 终止剂(ddNTP) DNA聚合酶 Sanger发明：两次获得诺贝尔奖 分别得到ddA ddT ddG ddC结尾的片段 测序过程: 1.模板与引物杂交 2.引物的延长和合成阻断 四个试管分别加入 DNA聚合酶 dNTP 标记底物 终止剂不同 ddA ddG ddC ddT 四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链 3.电泳 ACGT次序 高压电泳 4.放射自显影得到直读图象 第十章 核酸分子杂交技术 概念：具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双链的过程。 探针 待测核酸 杂交分子 核酸分子杂交的基本原理 核酸分子杂交的基本方法 探针的标记 核酸分子杂交的基本原理 DNA变性 方法 热变性：90~100℃ 酸碱变性：常采用碱变性 化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等 特点：粘度增加、密度增加、增色效应、溶解温度(melting temperature,Tm) DNA复性或杂交(hybridization) DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等 影响杂交的因素 核酸分子的浓度和长度 浓度大，复性快；分子量大，复性慢 温度 离子强度 杂交液中的甲酰胺 核酸分子的复杂性 非特异性杂交反应 预杂交：封闭非特异性杂交位点，用鲑鱼精子DNA 分子杂交的基本方法 Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交 Southern 印迹杂交 1975年，英国Southern创建 DNA/DNA杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。 Southern 杂交(Southern bloting)的主要步骤 待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA的变性：碱变性 Southern转膜： 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 探针的制备 Southern杂交 杂交结果的检测 Northern 印迹杂交(Northern bloting) 检测RNA（主要是mRNA）的方法 与Southern杂交的不同 靶核酸：RNA RNA电泳 转膜：不需变性 斑点印迹杂交(dot bloting) 将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上 优点：简单、快速、可同时检测多个样品 原位杂交(in situ hybridization) 将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。 特点 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态 核酸原位杂交的基本步骤 细胞或组织的固定：载玻片 组织细胞杂交前的预处理 用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质 探针的选择和标记 杂交 杂交结果检测 Western 杂交印迹法(Western bloting) 检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法 主要步骤： 蛋白质样品的制备 SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳 蛋白质的电转移：NC膜 靶蛋白的免疫学检测 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 显色反应：酶促反应 液相杂交 核酸分子与核酸探针存在于杂交液中 RNA酶保护分析法 核酸酶S1保护分析法 探针的标记 探针的种类 cDNA 探针、基因组DNA探针、寡核苷酸探针、RNA探针 标记物 核素标记物（同位素标记）：32P、35S、3H等 非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地高辛、荧光素等 探针标记方法 缺口平移法(nick translation) 随机引物法(random primer)：六核苷酸残基的引物 PCR标记法 末端标记法 探针的纯化 * bp —1534 — 994 — 695 — 515 — 377 — 237 A B C M *