噬菌体展示短肽亲和配基筛选与亲和色谱及研究.pdfVIP

中文摘要 中文摘要 本文主要针对使用噬菌体展示系统获得目标蛋白质的亲和配基和将该配 基应用于目标蛋白质的亲和色谱分离进行了研究。 首先以溶菌酶为目标蛋白质筛选七肽噬菌体展示库，在借鉴传统肽库筛选 方法的基础上，建立了一种新型筛选方法一交替洗脱法，即使用甘氨酸缓冲 液和高浓度目标蛋白质溶液轮流对结合于蛋白质表面的噬菌体进行洗脱。通过 与其它多种洗脱方法进行比较，以及将每轮实验各次洗脱液中噬菌体对目标蛋 白质的亲和力的对比，证明该方法能够有效回收使用其它操作方法可能丢失的 高亲和力噬菌体，而且可以太幅度缩短获得目标配体的时间，同时具有简便易 行等优点。 利用新建立的交替洗脱法，使用其它目标蛋白质对噬菌体展示肽库进行筛 选，又获得了对胰岛素和核糖核酸酶A具有高亲和力的噬菌体。选择与目标 蛋白质亲和力不等(高等、中等、低等)的多个噬菌体进行DNA测序，获得 相应氨基酸序列，发现与溶菌酶、胰岛素和核糖核酸酶A亲和性最高的噬菌 体展示肽序列均为HⅣWwPAs，将产生该现象的原因进行了分析，同时还对 不同序列展示肽与目标蛋白质的亲和吸附机制进行了探讨。 合成上述高亲和性肽段，并固定于琼脂糖基质上装填亲和色谱柱，研究了 不同蛋白在亲和色谱柱上的吸附行为。通过调节流动相的pH值和离子强度， 并使用尿素和乙二醇分别对吸附蛋白进行洗脱，详细研究了吸附效果最好的目 标蛋白质(胰岛素)与肽配基之间的亲和吸附机理，发现静电作用和氢键是二 者之间产生亲和吸附的主要作用力，而疏水相互作用对该亲和几乎没有贡献。 进一步考察了操作流速对胰岛素在肽配基亲和柱上吸附的影响，测定计算 了胰岛素在亲和柱上的动态吸附等温线，获得了该亲和柱的最大容量和结合常 数，并使用其分离纯化模式混和蛋白和猪胰腺粗提液中的胰岛素，取得良好效 果。另外，将该亲和柱用于卵清蛋白中溶菌酶的分离纯化，也取得了令人满意 的结果。 关键词：噬菌体展示肽库，肽库筛选方法，肽配基，亲和吸附机制，亲和色谱， 胰岛素 ●_-——●———____●_————●——●-____-—___-●_I___—_-_—_______-_--—●-_____-●——————●_●——————————一一一 垒呈!坠里! TRACT ABS the of to This describedwork library displaypeptide paper screeningphage for desired and the obtain some proteinsby purifying highaffinityligand proteins columnmodifiedwith affinity that peptideligands． froma An fortheselectionof clones efficient hi曲affinity procedure Was w瞄usedaSamodel library phagedisplay developed．Lysozyme he