杏鲍菇遗传转化体系建立与pyrG基因克隆.pdf

摘要 杏鲍菇(Pleurotus 具有很高的食药用、经济和生态学价值。杏鲍菇在消费者中的受欢迎程度及其年产量 越来越高，然而目前以杏鲍菇为对象的分子生物学相关研究很少，在育种和生物技术 研究中缺乏一种可靠的分子生物学工具。本研究目的在于建立高效的杏鲍菇遗传转化 体系，它不仅可以促进其分子遗传学方面的研究，同时还可以开发一种具有潜力的、 新型的外源蛋白的表达系统。本研究首先克隆获得杏鲍菇内源gpd启动子和终止子， 构建杏鲍菇表达载体pEPUGH，以液体培养的杏鲍菇单核菌丝为试验材料，获得具有 再生活力的原生质体，采用PEG／CaCl2介导法转化原生质体，以使报告基因哆咖在杏鲍 菇中获得表达；并通过巢式PCR和染色体步行技术克隆获得杏鲍菇pyrG基因，为今后 杏鲍菇安全筛选标记转化系统的建立奠定基础。本研究得到以下结果： 1．根据已报道的香菇gpd启动子与终止子序列设计引物，以单核杏鲍菇基因组 DNA为模板，通过PCR扩增获得杏鲍菇硼动子(1065 bp)与终止子(988bp)。 选标记基因hph，将其插入到含报告基因增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)的质粒 获得重组质粒pEPUGH，成功构建了含eg经。一hph融合基因的杏鲍菇表达载体。 3．以0．6mol／L甘露醇为原生质体释放稳渗剂，32℃酶解杏鲍菇菌丝体1．5h，成 功制备杏鲍菇原生质体；通过杏鲍菇原生质体对潮霉素的抗性试验，确定杏鲍菇原生 质体再生对潮霉素的最敏感浓度为60 gg／mL。 DNA·10 化效率为90-210个转化子／(斗g7个原生质体)，转化子在荧光倒置显微镜下可 以观察到其菌丝体发出的绿色荧光，成功建立杏鲍菇原生质体转化体系。 5．通过将获得的杏鲍菇转化子和对照非转化杏鲍菇分别同时进行出菇试验，经过 100天左右的培养，杏鲍菇转化子和对照杏鲍菇均可形成原基并正常出菇，且形态相近。 6．通过巢式简并PCR技术扩增获得约300 bp的矽)，rG保守序列，通过染色体步行技 术克隆获得保守序列上游序列长672 DNA bp，下游序列长841bp。序列分析可矢NpyrG 序列全长920 13 bp，其cDNA序列全长8 序列同源性比对，杏鲍菇pyrG基因编码的氨基酸序列与平菇、裂褶菌和草菇分别有 93．1％、59．1％和57．8％的相似性。 关键词：杏鲍菇；原生质体；PEG介导法；eg砸v—hph融合基因；pyrG ofthe Geneand Cloning EstablishmentofTransformation pyrG ofPleurotus System eryngii M．A伊．Candidate：Yin Yonggang Supervisor：Prof．Li Ming Prof．Liu妇 Olericulture Major： inEdible Studyfield：BiotechnologyGenetie