血管平滑肌细胞容积依赖性Cl-%27--运动调控机制及研究.pdf

!坚篁塑里塑塑查堡堡塑竺壑塞三垩塑塑堡垒型塑堡塞——二生望塑生一 血管平滑肌细胞容积依赖性Cr运动调控机制的研究 专 业：药理学 博士研究生：任京力 导 师：关永源教授 中文摘要 c1。是细胞内、外液中分布最广泛的阴离子，C1一的跨膜转运参与了细胞的多 种生理功能，如血压调节，细胞增殖与凋亡，肌肉张力，细胞容积调节，突触递 质传递及细胞兴奋性等。C1一通道普遍存在于真核细胞的细胞膜和细胞器膜，许 多疾病的发生、发展与C1一通道的功能缺陷密切相关。从功能角度考虑，根据通 道电生理特点，cl一通道可分为以下六类：(一)CICCl一通道家族；(二)囊性纤 维跨膜电导转运予；(三)肿胀激活的Cl一通道；(四)Ca”激活Cl一通道；(五)p64 基因家族胞内C1。通道；(六)配基门控的C1通道。而在外周血管平滑肌细胞， 目前已经确认与平滑肌收缩和平滑肌细胞增殖密切相关的Cl’通道有两种：Ca2+ 激活的C1一通道和容积依赖性的Cl一通道。对于Ca“激活的Cl一通道，认为多种生 物活性物质(如内皮素，血管紧张素II，去甲肾上腺素及ATP)均可激活血管平 滑肌细胞上相应的受体，促进胞内ca2+释放，胞内Ca”浓度瞬即升高，继而导致 c矿激活的cl‘通道开放，cl一外流，使胞膜去极化，促进电压依赖性ca”通道开放， 导致外c矿内流。对于容积依赖性cl一通道，许多研究表明C1c一3基因编码的c1一 通道蛋白是一种容积调节性的Cl‘通道，或者至少是容积调节性Cl一通道的组成部 分。记录到的C1c一3 cl一通道电流具有外向整流特性，电导为30--60p$，通道 位可使该通道失活；它的分子基础目前仍不明确，已经提出的候选对象有CIC-- 和蛋白ICln只是容积调节性cl一通道的调节分子，Clc一3 cl一通道是它的物质基 血管平滑肌细胞容积依较性氯离子运动调控机制的研究 中文摘要 础。 越来越多的研究表明，cl+通道参与了皿管平滑肌细胞(VS}nCs)收缩和增殖 功能的调节，但是参与此过程的cl通道的分子基础及作用机制仍未阐明。而血 管平滑肌细胞的收缩和增殖是许多心血管疾病发病的重要因素，因此，研究血管 平滑肌细胞c1一通道的调节机制可为寻找有效防治心脑血管疾病的治疗方案提供 新的理论依据。 由于缺乏特异性高亲和力的通道配基、缺乏不含VRAC的细胞株以及研究Cl+ 通道的活性方法(如细胞内电极法、同位素示踪法、SPQ法)存在许多局限性， 对cl一通道的研究进展很慢，近年来，由于膜片钳技术的应用，第二代的荧光探 针(MEQ)的问世以及分子生物学技术的发展，对血管平滑肌细胞容积依赖性Cl一 通道的研究己成为热点。那么，在VSMCs上，ca”激活的c1一通道的调控机制如何? 容积依赖性cl一通道的调控机制如何?容积依赖性c1‘通道分子基础与clc～3蛋 白的关系究竟如何? 基于以上所述，本研究分为三大部分。第一部分是在血管平滑肌细胞(A】0 细胞)上建立胞浆内游离[cl一】i检测的方法，并且经过校正得出静息状态下AIO 细胞胞浆【cl’】i；第二部分是在AIO细胞上，探讨ca2+激活的Cl一运动和容积依赖 性cl。运动的调节机制；第三部分则应用分子生物学技术从形态和功能两个角度 探讨容积依赖性c1。通道的分子基础。 第一部分AIO细胞胞浆内游离[cql测定方法的建立 荧光法测定胞浆内【C1]i的始于上世纪九十年代，SPQ 琐，且对细胞的损伤很大，因此逐渐被第二代的荧光探针MEQ (6一Methoxy-N—ethylquinolinium iodide)替代。MEQ本身对cl‘非常敏感，其荧 光通过分子碰撞机制淬灭，但它不容易通过细胞膜，通过改良的合成方法，可将 其还原成可通过细胞膜的DiH-MEQ，DiH—MEQ对Cr不敏感，在细胞胞浆内很 快被胞浆内一些氧化酶重新氧化成MEQ，很少泄漏，并且对细胞没有明显毒性。 因此可以用本实验室的生物影像双波分析仪动态地观察单个细胞胞浆内游离