三类新型集成化的基因芯片及相关仪器的研制.pdf

摘要 中文摘要 论文题目：三类新型集成化的基因芯片及其相关仪器的研制 博士研究生：刘全俊 导师姓名：陆祖宏教授 学校名称：东南大学 摹凶芯片技术是一种高通晕的现代牛物检测技术，在功能摹因研究、新药筛选、疾病的基凶诊 断等领域具有广泛的应用。基因芯片检测是一个复杂的过程，包括：靶摹凼的扩增、扩增产物的标 记、芯片杂交与清洗、杂交信号检测及分析等。在这样的一个复杂枪测流程中，容易产生由于操作 过程的复杂性而带来的榆测结果不稳定，从而影响了基因芯片的推广应用。我们研制基因扩增杂交 一体化检测仪的目的是为了实现从基因扩增、荧光杯记、杂交与清洗、芯片信号检测的一系列流程 的自动化操作，以减少检测结果的人为因素的干扰，提高基凼芯片在基因多态性分析及疾病诊断等 方面的应JI}j水平。为了进一步简化基因自’增杂交榆测一体化芯片结构发其仪器的复杂性，我们义提 出了管盖基因芯片。为能够对多个靶摹因实现定量检测，我们在本实验章提出的TaqMan微阵列芯 片的基础上，设计和研制了定量基凶芯片检测系统，并设计了一种新的FRET定茸检测基凶芯片， 可用于同一样品中不同基因的高通量定量检测。 1． 基因扩增杂交一体化芯片及检测系统 针对基因芯片检测过程的复杂性，我们设计了集成化的操作平台一基因扩增杂交检测一体化芯 片，用于实现基因扩增、杂交、清洗、检测的自动化以减少复杂操作过稃中的人为因素影响。基因 扩增杂交检测一体化芯片的结构包括二个功能区域：十四个通道的玻璃毛细管作为基因扩增区域和 由十四个在玻片上固定了核酸探针阵列的基因芯片组成的杂交检测区。使用了硅胶作为密封件，分 别将二个区域相连。该芯片可实现十四个通道的基因扩增与基因芯片检测一体化，检测样品流稃所 需要的时间为3-4小时。 摹于上述牛物芯片，我们设计和研制了摹因扩增杂交一体化检测仪，能够进行PCR、生物芯片 杂交和荧光检测的一体化操作。基凶匆’增杂交一体化检测仪主安由温度精确拧制系统、样品自动注 入系统和荧光检测几部分组成，包括：计算机、加热炉、荧光显微镜、温度控制器、试样装夹及送 进机构、运动控制箱、清洗机构等。与南京依科机电有限公司合作开发出相应的产品，通过了江苏 省医疗器械检测所的检验，建立了医疗器械注册产品标准。该仪器有如下的结构特点： 利用蠕动泉，电磁开关等进行液体的控制。通过软件控制，实现了反应体系在基因扩增区域 与杂交区域的密封与流动。通过液体的输送，实现了基因扩增产物与杂交液的混合及与芯片 的杂交反应。 (2)杂交过程的温度控制通过空气介导的温控体系来实现。具有变温快、温度场均匀等优点。此 仪器能够对PCR反应区的温度进行精确控制，其温度上升的速率可达到20。C／s，下降的速率 可达到10。C／s。 (3)芯片的荧光杂交信号检测是通过荧光显微镜与CCD的图像采集技术实现的。芯片被固定在 二维移动平台上在显微镜下进行荧光信号的扫描阅读，在PC机上显示，存入计算机。 基于上述芯片和仪器，我们发展了用于乙型肝炎基因突，变检测的试剂，可以对乙型肝炎YMDD 突变基因进行检测，并在南京市第二医院进行了l临床检测，检测准确率达剑100％。通过与在普通 变堡查兰堕主堂堡丝奎 玻片琼脂糖幕膜上固定了用于检测YMDD突变的分子信杯探针芯片的检测结果进行比较，得到了相 似的杂交检测信号。结果表明，这种新型的生物芯片可以满足临床检测的需求。 2． 管盖基因芯片及检测系统 为进一步简化上述基因扩增杂交检测一体化芯片的复杂性，我们提出了直接在Eppendorf管内 完成基因芯片的基因扩增杂交检测的新方案—管盖基因芯片技术。管盖基因芯片是一个基因扩增到 杂交检测的全封闭器件，基因探针同定在特制的基因扩增管的管盖内表面，并在这个封闭的体系中 加入了一个杂交液贮液池。研究结果表明．管盖基因芯片能够成功地在一个全封闭且无清洗的基因 芯片体系内实现多重基因扩增、芯片杂交及杂交信号的荧光检测过年旱，而且能够有效地避免了不同 样品『日J基凶扩增产物的无交叉污染。 我们设计和研制了相应的管蔫摹因芯片检测系统。检测系统包括荧光显微镜与CCD等硬件，以 及相关图像分析和数据处珲软件。该软什可对杂交结果进行图像捕获、贮存并进行图像分析、杂交 强度计算、检测结果标准化与数字化。 在管盖基因芯片研究的基础上，我们设计