纳升级多维液相色谱法及研究蛋白质组.pdf

摘 要 蛋自质组学的研究方法，主要依赖于分离技术和检测技术的突破性进展。 克服的缺陷，寻找2D的替代技术是目前生物技术领域研究的一个热点。 发展两维乃至多维色谱分离方法。可从根本上解决这个问题。 本研究以研究多维色谱分离方法为主要方向，搭建了一个纳升级的二维液相 色谱分离平台，并将此用于人肝癌蛋白质组的分离与鉴定中，经过条件优化，发 现该平台具有很好的分离能力，可以完全实现自动化，是一个无歧视性的蛋白质 组分析平台。用此平台，鉴定出入肝癌蛋白质组中的229种蛋白，其中一些与肝 癌的发病机理有关。同时发现在整个蛋白质鉴定中，多肽在LC中预测的保留数 据可以辅助串级质谱鉴定出更多的蛋白，提高了鉴定的数量和鉴定的可靠性。并 进一步对此LC保留模型进行了改进，使它更适合于预测大的肽段的保留，获得 了满意的结果。 本研究共分三大部分，主要内容如下； ． HCC)是全世界发病率最高的五大癌症之一。 1．肝癌(Hepatocellularcarcinoma 为了了解肝癌发现的机理，蛋白质组学提供了一个强有力的分析手段。搭建一个 自动的纳升级全二维分离体系(nano 组，其中强阳离子交换(scx)为第一维，毛细管反相液相色谱(cRPLC)为第二维。 使用这个系统，复杂样品的上样，除盐，分离和分析可以达到完全的自动化。经 过分别对两维的条件优化，这个蛋白质组分析程序可以用于分离和鉴定大分子量 的蛋白(100 ooo)，小分子量的蛋白(20ooo)，强碱性的蛋白(p，9．5)和疏 水性的蛋白，而这些蛋白在二维凝胶电泳上都不能得到很好的分离。最后运用这 个系统鉴定了人肝癌细胞中229种蛋白。在它们中阔，一些蛋白被发现与肝癌的 发生和病变有关。并在此基础上，发展SEC．SCX—RPLC三维色谱分离模式。 2． 二二维液相色谱在线的偶联电喷雾串级质谱是蛋白质分离与鉴定的一个新平 台。～般多肽首先由2D．LC进行分离，然后用ESl一MS／MS进行分析，最后用 串级质谱产生的数据度对其进行鉴定。在一次2D—LC．ESI．MS／MS分析中不仅能 够直接从质谱中得到多肽蓊质比的信息沏拓)，而且也能够周对得到多肽在LC上 的保留时间，而多肽的保留时间一直未能与串级质谱相联用来鉴定蛋白。在本研 究中，发现用组成肽段的每个氨基酸的疏水性贡献对多肽在RPLC上的保留进行 预测，从而可以使多肽的色谱信息辅助串级质谱鉴定蛋白。这样，蛋白可由四种 类型的信息来鉴定，一是肽质量指纹图谱(PMF)，序列信息，MS／MS离子得分， 预测的保留时间。这个附加的信息可辅助串级质谱鉴定蛋白，鉴定率提高了16％， 而且不需要花费额外的费用。 3．小肽的保留可以通过组成多肽的每个氨基酸的疏水性贡献的加和来预测。但 当多肽的长度大于10．15残基时，多肽的保留时间要小于氨基酸残基的保留系数 相加得到的预测结果。在本章中，考虑多肽的长度和每个氨基酸残基与固定相的 接触面积。提出了一个新的预测模型。对这个模型用实验数据和文献数据进行验 证，发现运用新模型可以提高预测的精度。而且也支持了最初的假定，对于小肽， 氨基酸的组成控制着它的保留。但对大的肽段来说，肽链的长度鞍每个氨基酸与 固定相接触的面积是影响保留的重要因素。而且，多肽链的范围越宽，预测精度 越好。同时发现非级性、极性和带电荷氨基酸与同定相接触的面积的比率都小于 1。 关键词：蛋白质组；多维液相色谱；多肽；保留：肝癌；预测；纳升级 Abstract Thefast of relieson for developmentproteomicsbreakthroughshighthroughput isthemostuniversalmethodfor analyticaltechnologies．2D—PAGE proteomics．Some in stilldifficulttobeovercomesuchaslimited 2D—PAGE，however,are problems