表达猪瘟兔化疫苗株E0蛋白的PK15细胞系构建和3′端非编码区研究.pdfVIP

中文摘要 本试验利用EGFP为转移载体和标志蛋白，对E0蛋白在PK．15．N胞内的表达和定位做了初步研 究，构建了能稳定表达E0蛋白的PK．1 5细胞， 一个12．nt(ttrtttctttttt)的片断，是猪瘟兔化弱毒苗区别丁石门株的标志，因此本试验选用PK．1 将HCLV株在PK．15细胞上连续传代34代，以期了解每一代病毒的增殖情况和插入标志12．nt的变 化，从而了解HCLV株在细胞上的增殖复制情况。从本试验出发，建议在疫苗生产中，尽量减少 传代次数。 1．从猪瘟病毒兔化弱毒株兔体480代后．牛睾丸细胞第3代的细胞毒中提取总RNA，以该总RNA 为模板，进行反转录，PCR扩增出了猪瘟病毒兔化弱毒株的囊膜糖蛋白EO基因，琼脂糖凝胶电 泳表明其大小与预计相符。将扩增出的E0基冈克隆到pGEMT-easy载体中，用自动序列分析仪 对其进行序列测定。将测得的序列与从GenBank中选取三株强毒株、三株弱毒株序列进行比较， 与C株的E0基因序列的同源性为98 12％。根据HCLV株的E0基因的核酸序列推导的氨基酸序 氨基酸序列的同源性为97．4％。将克隆到pGEMT-easy载体中的E0基因双酶切回收后，连接到 到了EGFP中。 2．利用脂质体分别将高纯度提取的pEGFP-N1 h，72 进行观察，在三种细胞中都可以观察到绿色荧光，而且在转染斤的24h，48 h三个时间点 上，观察到的荧光细胞数量逐渐增多，在72h时荧光细胞的数量在三种细胞中都达到最多，总的 来看，在PK．15中荧光细胞的数量最多。通过对细胞荧光的定位发现，重组质粒的荧光主要分布 在胞浆内，而且细胞核周围的荧光较强，胞核与胞浆的界限明显，尤其是在PK-15细胞和VERO Vector转染三种细胞后．都可以观 细胞中这种现象尤为明显。未携带E0目的DNA的pEGFP．Nl 察到绿色荧光，但是整个细胞中是均匀出现荧光的。 PK．1 5细胞中没有E0的表达。 以看出：病毒感染72 h的培养液中其滴度达到最高值，随后迅速下降。HCLV株在PK．E0细胞中 达增加了HCLV在细胞中的复制。 5．通过将PK，EO细胞连续传代30代，在连续观察期问发现PK-EO细胞在形态、贴壁生I殳等方面 均没有变化，证明获得的PK．EO细胞是稳定的。 多插入了一个T；第28、29代在碱基c的右侧多插入了多2个T；第30、31代在C的左侧多插 入了多6个T，碱基c也变成了T；第32、33代在c的右侧缺失了2个T，碱基C也缺失：第 34代在c的左侧缺灾了5个T，在C的右侧缺失了5个T，碱基c也缺失，并且在第86位由原 来的A变成G，第92位由原来的T变成C。 7．将HCLVl--34代病毒接种24孔板中长满单层的PK．15细胞，于接种后72h进行荧光抗体检 查，比较不同代次HCLV在PK．15细胞上增殖的差异。结果发现，从28代病毒滴度有所下降。 关键词猪瘟兔化弱毒株，囊膜糖蛋白E0基因，克隆，序列测定，增强型绿色荧光蛋白 II Abstract EGFP aS wasused vectorandmarker eukaryoticexpression researched glycoprotein．we andlocationof E0afteritwastransfected intoPK一15 of expression glycoprotein