白木香（Aquilaria sinensis（Lour）Spreng）的遗传多样性的研究.pdf

摘 要 白木香(彳驰f肠，m 属(Aquilaria)双子叶常绿乔木，是我国名贵药材国产沉香(LignumAquilariae Resinatum)的药源植物。白木香不仅有很高的药用价值，而且还有极高的经济价 值。随着人们对沉香需求量的增加，沉香价格不断攀升，市场上出现了大量伪品、 劣品，严重扰乱了药材市场的秩序。稀少的白木香资源限制了国产沉香的药材供 给，高额利润的追逐更加重了其资源的破坏．目前白木香己经被列为国家二级重 点野生保护植物，但是迄今为止未见任何遗传学的报道。进行自木香遗传多样性 的研究，为了解和保护有限的白木香资源，对其进行科学合理的开发利用，奠定 了坚实的基础；也为鉴别药材物种，实现药材的质量控制，提供了丰富的基础研 究数据。 本研究首先通过野外实地测量收集了大量形态学数据，运用数量遗传学的方 法从形态学水平研究了白木香的表型多样性。其次，用核型和C．带型技术，从细 胞学水平比较研究了广东、广西和海南三个省份白木香染色体核型和带型的差 异。再次，用AFLP分子标记技术，从分子生物学水’I‘构建了白木香的AFLP银 染指纹图谱，初步分析了其遗传变异。本文的主要研究结果如下： 1．调查收集了广东、广西、海南和云南四个省份9个居群的白木香样品，选 择10项形态性状进行测量，用统计学的方法进行正态性检验、方差、相关和聚 类分析，研究其表型多样性。结果表明，所选的形态性状均符合正态分布；方差 分析表明，各性状在白木香居群间和居群内均存在广泛的变异性，居群间F值在 水平。居群内平均方差分量为52．62％，说明屑群内的变异是白木香表型变异的主 要部分；白木香居群间平均表型分化系数为33．38％，说明居群内的多样性程度大 于居群问；多重比较还表明白木香各居群间变异系数和相对极差均无显著性差 异；各群体重复力均值差异不显著，各性状的重复力平均值为O．496：各形态性 状间和性状与地理因子问的相关关系分析将lO项形态指标分为关联较紧密的三 组；各地理因子中海拔对性状的影响较大，其次是年均气温和年降雨量；UPGMA 法在阈值为10时，把白木香聚成了4组。 2．用常规压片法制作标本，分别研究了广东、广西和海南三个省份的白木香 核型和带型。结果表明，三个省份的白木香核型类型一致，均为2B型；核型公 白木香核型不对称系数(As．K．％)变化较小，说明白木香染色体具有较高的不对称 性，进化程度较高；白木香染色体居群间的方差分量平均值为39．50％，说明居群 间的变异大于居群内的变异；三个省份白木香染色体的带型有所不同，C．带的位 置不同，数目也有较小差别。总体来讲，白木香染色体带型不够丰富，每条染色 体可显示1～4条C．带，大多数染色体有2条带。带型以末端带，着丝粒带和中 间带为主。长臂和短臂上均有带纹的分化，有部分末端带、中间带和全带，说明 白木香在进化体系中处于较高的进化地位，与核型分析结果一致。 3．使用六种试剂盒尝试提取白木香的基因组DNA，结果表明，试剂盒均不 能获得高质量的基因组DNA。传统CTAB法经改良、优化后可以获得纯度高、 完整性好的DNA。样品保存方法对基因组DNA的提取效果有较大影响，短期硅 胶干燥和一70℃保存均可以较好地保存基因组DNA。与传统CTAB法相比，改 良的CTAB法在加入裂解液之前增加了生理盐水洗涤一步，使用较高NaCI浓度 (2．5mol／L)的提取缓冲液裂解样品，加入适量蛋白酶K辅助去除蛋白，并在氯 仿，异戊醇抽提步骤中增加加入适量lO％CTAB溶液一步。优化结果表明，增加 提取缓冲液中CTAB和B．巯基乙醇的浓度对提取效果没有显著影响；加入1％PVP 最为经济有效，添加量大于3％时，反而会对提取产生不利的影响；裂解时阅以 45min为宜：低转速长时间离心效果优于高转速短时间。 4．通过优化AFLP银染技术的参数，建立了白木香AFLP银染体系。使用 226条带，其中190条为多态性条带，占总条带数的84．07％，平均每条引物可以 扩增出75．33条带。白木香和云南沉香的指纹图谱有明显的差异，以此可区分两 个物种。居群水平多态位点百分率为19．03％，Nei’S基因多样性指数平均值为 均较低；三者大小j{}列顺序基本一致，云南纳板河居群(NB)最小，表明该居群 的遗传多样性最低。Nei’S遗传一致度、遗传距离和UPGMA聚类分析表明，广 东茂名和广西药用植物园的白木香亲缘关系较近，最先聚合，NB明显和其他白 木香居群有较远的亲缘关系，最后聚类。白木香DNA聚类结果和实际地理分