细胞转染技术宋晓萍.ppt

（7）阳离子脂质体试剂冻结。? 不要使用冻结的或储存温度低于4℃的阳离子脂质体试剂。 （8）转染分析的问题。 转染分析中加入阳性对照。 （9）质粒纯化的问题。 请核对是否使用转染级的质粒纯化试剂盒。通常转染级的质粒纯化试剂盒使用DEAE树脂而非硅树脂，并且最好是用重力流动（过滤）的方法而不是离心技术，因为树脂带来的污染会导致较高的内毒素。另一种方法（可用于任何级别的纯化试剂盒），是在最后一步从树脂柱上洗脱质粒后，将溶液置于55℃的水浴上保温5分钟。最后小心地从上至下吸取2/3的溶液（不要碰到底部）使用。这是减少树脂的交叉污染的方法。 Q2：细胞死亡率高。 （1）DNA量太高。 作一个剂量-反应曲线以确定最佳的DNA量。 （2）阳离子脂质体试剂量太高。 ?作一个剂量-反应曲线以确定最佳的阳离子脂质体试剂的量。 （3）在转染过程中使用抗菌素。 在转染过程中不要使用氯霉素，青霉素或链霉素，因为阳离子脂质体试剂使细胞更敏感。 （4）细胞太少。 调整细胞数量。 （5）无血清条件细胞活性降低。 使用OPTI-MEM培养基。降低或省去在无血清培养基中清洗的次数。 （6）阳离子脂质体试剂氧化了。 不要过分搅动或振荡阳离子脂质体试剂；这可能会形成阳离子脂质体试剂的过氧化物。 （7）对于稳定转染，筛选抗生素加入的太快。 在加入筛选性抗生素前至少预留48小时使细胞表达抗性基因。 Q3：阳离子脂质体试剂-DNA复合物沉淀。 在显微静下可以在细胞上观察到小的颗粒状颗粒沉淀。这是正常的。此沉淀是否存在并不表明转染效率的高低。 （1）存在过剩的EDTA。? （2）DNA或阳离子脂质体试剂浓度过高。 ?确保阳离子脂质体试剂和DNA的浓度不要超过复合物形成的建议量 使用DNA水溶液，如果是在TE中，使用浓度0.3mM的EDTA溶液稀释DNA。 Q4： 转染重复性不好。 （1） 转染时的融合度波动。 在不同的转染时报持所有的转染参数恒定，如融合度，传代次数和生长时相等。 （2）在培养中细胞发生变化 如果可能，使用来源于经选择转染效率较高亚系的细胞。如果可能，融化新鲜细胞。 * endosome[细胞] 核内体 * 感受态细胞(Competent cells)：受体细胞经过一些特殊方法(如：CaCl,RuCl等化学试剂法)的处理后, 细胞膜 的通透性发生变化,成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) .???? 转化(transformation)：是将异源DNA分子引入一 细胞株 系,使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段,是基因工程等研究领域的基本实验技术.? 在选择性培养平板上，可选出所需的转化子（即含有质粒?DNA?的细菌）。钙处理的感受态细胞，一般每微克?DNA?能获得?10?5?～?10?6?个转化子。除化学方法转化细菌外，还有电穿孔法（?Electroporation?），其转化率可高达?10?9?～?10?10?个转化子?/μg?质粒?DNA?。 * 慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。 * 细胞转染技术 汇报人：宋晓萍 2015.5.9 目录 基本原理 1 质粒提取扩增 2 3 4 常见问题及解决方案 5 影响转染实验的因素 转染方法 基本原理 1 将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。 细胞转染—— 研究内容：研究和控制真核细胞基因功能 应? ???用：基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验 常规转染技术 瞬时转染 外源 DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性 DNA 比超螺旋 DNA 转入量低但整合率高。外源 DNA 整合到染色体中概率很小，大约 1/104 转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素 B 磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。 稳定转染 外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒 DNA 转染效率较高，在转染后 24-72 小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果， 常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β 半乳糖苷酶等来帮助检测。 脂质体介导转染 脂质体转染的原理基于电荷吸引原理，先形成脂质体-DNA复合物，散布在细胞周围，然后通过细胞的内吞作用，将目的基因导入细胞内。 1. ?promega公司 ? Promega转染试剂产品适合于人HeLa，Hep G2，