华支睾吸虫转录和代谢酶相关基因的表达及其生物学活性初步鉴定.pdf

华支睾吸虫成虫转录和代谢酶相关基因的表达及生物学活性的初步鉴定 中文摘要 sinensis，又名肝吸虫)病是流行于我国(特 华支睾吸虫(Clonorchis 别是华南地区)常见的人兽共患寄生虫病。华支睾吸虫成虫寄生于宿主 的肝胆管，可引起胆管及胆管周围炎症反应，导致胆管局限性扩张、胆管 上皮细胞增生，严重的导致胆汁性肝硬变、肝癌。近年来随着模式生物 功能基因组研究的展开，研究者已从传统的华支睾吸虫病预防、治疗免 疫学机制研究等转移到分子生物学机制研究。如果从功能基因组学研究 角度入手，弄清楚华支睾吸虫在其复杂的生活史中基因的表达调控、酶 代谢生理、虫体与生态环境等宿主相互作用的独特生命活动规律，有望 搜寻到新的药物作用靶点和诊断候选抗原／候选疫苗。综合查阅国内外文 献可见，有关华支睾吸虫基因组及功能基因组的研究工作甚少，目前华 支睾吸虫功能蛋白的研究尚属空白区，因此筛选华支睾吸虫功能基因， 寻找理想药物靶标和候选抗原具有重要意义。 II RPEF(RNA factor)是一类分布于真核生物 elongation polymerase 的RNA聚合酶II延长因子，大部分真核蛋白编码基因的表达都要受到 启始和延长阶段集中调节于RNA聚合酶II的活性，其功能活性在于防止 时停滞。TC(Transcriptional 转录激活蛋白，TC因子可与真核基因启动子区域中的顺式作用元件发生 特异性相互作用，也可与其它蛋白受体共同作用而激活目标基因的转录 过程。真核生物的TC因子由DNA结合区，转录激活区，寡聚化位点和 核定位信号这4个功能区域组成，TC因子通过这些功能区域与目标基因 启动子中的顺式元件作用或与其它转录因子的功能区域相互作用来调控 基因的转录表达，上述途径是所有真核基因转录调控的基础。GAPDH (Glyceraldehyde一3一phosphate f脱氢)和磷酸化，生成1，3．二磷酸甘油酸，是糖代谢的中心环节。3． 华支睾吸虫成虫转录和代谢酶相关基因的表达及生物学活性的初步鉴定 酶活性外，还参与膜转运、微管装配、核RNA转运、甚至基因表达的翻 译调控等过程。GAPDH分子在人体寄生虫中还有一些非糖酵解的功能， 包括小泡传送器和顶体细胞器生物起源功能等。本次研究由华支睾吸虫 质粒文库中筛选出来的RPEF、TC、GAPDH基因，这三个基因均为从未 报道过的未知基因，是可能参与华支睾吸虫基因表达调控机制和酶代谢 生理途径的重要蛋白，如若能获取这些新的编码基因并明确它们的功能 可为寻找华支睾吸虫理想药物靶标和候选抗原提供理论基础。 本次研究利用生物信息学方法，对华支睾吸虫cDNA文库的EST序 polymerase 列进行大规模同源性分析和Unigene拼接，筛选出RPEF(RNA II factor)、TC coactivator)、GAPDH elongation (Transc“ptional (G1yceraldehyde．3．phosphate 象，其研究内容主要包括： 5端测序结果和了端测序结果， 对华支睾吸虫cDNA文库所有ESTs 序列拼接。使用NCBI上的Blastx程序寻找同源蛋白，预测编码蛋白的 编码蛋白的二级结构特征及搜寻功能性位点(Site)、功能性结构域 切和测序鉴定重组子是否正确。将重组子pGEX一4T一1一RPEF、 蛋白分子量是否与预测值一致。使用GST的单抗和抗华支睾吸虫免疫兔 血清进行Western GST．Bind”kit和His·Bind“Purificationkit按照操作说明亲和纯化重组 行酶切，Wash 华支睾吸虫成虫转录和代谢酶相关基因的表达及生物学活性的初步鉴定 的浓度分别进行测定。上述实验结果表明此次实验所获得的纯化蛋白可 以很好的用于后续的基因生物学功能和结构的实验室鉴定。将纯化的目 各其免疫蛋白抗血清。采用间接ELIS