蛋白质含量测定考马斯亮蓝染色法.pptVIP

实 验 一 实验室规则 考勤 实验操作 实验室安全（仪器、药品、水、电等） 值日（桌面、地面、门、窗、水、电等） 考试 ① 实验名称 ② 实验目的 ③ 实验原理（简述) ④ 实验材料、仪器及其试剂 ⑤ 实验方法与操作步骤（工艺流程图或表格方式） ⑥ 实验结果及分析（实验现象或实验结果数据整理、归纳、分析和对比） ⑦ 讨论（实验方法、操作步骤、实验正(异)常结果、建议等） 标准的实验报告应该简洁明了地给出使别人能够重复你的实验所需要的全部信息。 一、实验目的： 1、学习利用考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量的原理及方法； 2、掌握分光光度计的使用方法； 3、掌握标准曲线的绘制。 二、实验原理： 考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中游离状态下为棕红色。 当它与蛋白质通过范德华键结合后变为蓝色. 蛋白质染料复合物对595nm可见光有最大光吸收. 在一定范围内（ 10 -1000ug/ml）其OD595nm值与蛋白质含量成正比，故可用分光光度法进行蛋白质的定量测定。 双缩脲反应： Folin-酚试剂法（Lowry法）： 紫外吸收法： 微量凯式定氮法： （1）双缩脲法： 原理是蛋白质含有两个以上的肽键（-CO-NH-）因此，有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫色络合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，故可以用来测定蛋白质含量. （3）紫外吸收法： 蛋白质中Trp，Phe，Tyr的残基中的苯环含有共轭双键，吸收高峰在280nm处，所以蛋白质具有吸收紫外光的性质，并且蛋白质溶液的光吸收值与其含量成正比，可用作定量测定。 简单、灵敏、快速、不耗样品，低浓度的盐类不干扰。 三、实验材料、仪器和试剂： 1、 实验材料：绿豆芽、小麦种子、葡萄、苹果 2、仪器：(1)S-22pc可见光分光光度计 (2)研钵 (3)离心机 (4)试管 (5)容量瓶等 3、试剂： （1）染色液：考马斯亮蓝G-250 (100mg 考马斯亮蓝溶于50ml 95%乙醇，加100ml 85%磷酸，加水稀释至 1L) （2）浓度：0.25mg/ml的牛血清白蛋白标准溶液。 四、实验步骤： 1、制作标准曲线： 取7支试管，依次分别加入0.0，0.10, 0.15, 0.20, 0.30, 0.40, 0.50ml的牛血清蛋白溶液，用水补足到0.5ml，每管均再加5ml染色液，立即摇匀，置室温下放置5分钟。然后测各管的OD595nm 值，绘制标准曲线。 标准曲线的绘制 目的：得到样品中蛋白质的浓度。 首先，用一组已知浓度的蛋白质溶液与考马斯亮蓝G-250反应,然后在595 nm处测定吸光度（OD）。 其次，绘制浓度与吸光度对应的曲线图。 最后，测定样品蛋白质的吸光度然后在曲线上找到对应的浓度。 1、制作标准曲线： 称取豆芽叶片1g → 研钵中加2ml水→研成匀浆→转入离心管→用水分三次冲洗研钵，每次2ml→均转入同一离心管 →等重后8000转/分离心10分钟→取上清液转入25ml容量瓶→定容。 取0.5ml提取液于试管中,加入考马斯亮蓝G-250 染色液5ml，充分混匀，放置5分钟，以制作标准曲线的1号试管为参比溶液，调吸光度为“0”，测豆芽提取液的吸光度A595nm，记录结果，查标准曲线，得蛋白质浓度X(mg/ml)。 五、结果计算： 分光光度技术 利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法，称为分光光度法或分光光度技术，使用的仪器称为分光光度计. 红外吸收光谱：波长范围2.5?1000 ?m,主要用于有机化合物结构鉴定。 紫外吸收光谱：波长范围200?400 nm（近紫外区）可用于结构鉴定和定量分析。 可见吸收光谱：波长范围400?750 nm ，主要用于溶液等的定量分析。 光吸收定律： 朗伯—比尔(Lambert-bee)光吸收定律： A＝lg（I0/It) ＝ -lgT ＝ εb c （1）A—吸光度 “OD”：描述溶液对光的吸收程度； 同一种溶液对不同波长光的吸光度是不相同的，在吸光度最大处所对应的波长称为最大光吸收处。 同一种物质不同浓度的吸光度，在某一定波长下有差异，在最大光吸收处吸光度的差异最大。这是分光光度法进行物质定量分析的重要依据。 I0：表示入射光强度，It ：表