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质粒载体 plasmid 主要内容 载体的概念及特点 载体的分类 质粒载体 教学目标 通过本节课的学习，学生要掌握载体的主要特点，其应该具备的元件，会灵活设计一系列的实验来证明宿主内转入了载体。 第一节 载体的特点 一．载体的概念 1.要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具），将外源DNA或者基因携带进入宿主细胞的工具。 　　2.凡来源于质粒或噬菌体的DNA分子，可以插入或克隆DNA片段统称为vector。 　　基因工程所用的vector实际上是DNA分子，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA。 二、载体应具备的条件 在宿主细胞内能够进行自我复制，具备复制原点。 有合适的限制性内切酶位点，每种位点最好有且只有1 个，供外源DNA的插入且不影响其复制。 有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验，便于筛选。 有一定容量且有较高的拷贝数，易于制备。 多克隆位点 ori 复制起始点 遗传标记 Amp polylinker 三、载体的分类 分类依据 类 别 克隆扩增或表达 举 例 按功能 （1）克隆载体 （2）表达载体 √ √ PBR322 PCDN3 按进入受体细胞类型 （1）原核载体 （2）真核载体 （3）穿梭载体 PUC8 PBUDCE41 YE √ 载体的分类 克隆载体（cloning vector） 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。 表达载体（Expression vector） 具有克隆载体的基本元件，还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。具有表达和调控能力的载体称表达载体。 第二节 质粒载体 1、质粒是细菌染色体外能自主复制的环形双链DNA分子。 2、编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒。 一、质粒的生物学特性 实验设计：把一个带抗性的质粒转化到一个不带抗性的宿主细胞中，如何区分转化进去质粒的细胞和没有转化进去质粒的细胞？ 3、质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态，但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体地复制而复制。 4、质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。 5、根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200个拷贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。 6、质粒的不亲和性：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。 质粒 复制子 拷贝数 pBR322 及其衍生质粒 pMB1 15～20 pUC 系列质粒及其衍生质粒 突变的 pMB1 500～700 pACYC 及其衍生质粒 p15A 10～212 pSC101 及其衍生质粒 pSC101 ～5 ColE1 ColE1 15～20 二、质粒上的标记基因 　　按其用途可将标记基因分为选择标记基因和筛选标记基因。 　　选择标记基因用于鉴别目标 DNA （载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。 　　筛选标记基因可用于将特殊表型的重组子挑选出来。筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒，当一个外源 DNA 片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。 1 选择标记基因 1 氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene） 2 四环素抗性基因（Tetracycline resistance gene） 3 氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene） 4 卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene） 5 琥珀突变抑制基因 supF 6）其它还有一些正向选择标记，表达一种使某些宿主菌致死的基因产物，而含有外源基因片段插入后，该基因便失活 r r 2 筛选标记基因 1 α-互补（α-complementation）又称蓝白斑试验（IPTG-X－gal 试验） 　　α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的 β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。 诱导物 Z Y X P O Z Y X P O 乳糖 X-gal Lac Z 蓝色化合物 X-gal 标志补救（?-半乳糖苷酶法） lacZ Am N2H ?片