巨型艾美球虫免疫原性相异株间消减cDNA文库构建与差异表达基因的分析.pdf

刘丹丹：巨叮!艾荚球虫免疫原性相异株l’HJ淌减cDNA文库的构建及其芹异表达基冈分析三 巨型艾美球虫免疫原性相异株间消减cDNA文库的构 建及其差异表达基因分析 研究生：刘丹丹 导师：陶建平教授 中文摘要 胞内引起的一种寄生性原虫病。在鸡的各类疾病中，球虫病发病率最高，是养禽 业危害最严重的禽病之一。目前，鸡球虫病的防治仍然以药物预防为主，但随着 耐药虫株的广泛出现，药物预防的效果越来越差，而且药物的长期使用会残留肉 蛋，污染环境，影响人体健康，故球虫病的防治趋势由药物转向了免疫预防。巨 疫原性和一定的交叉免疫保护力，故在球虫疫苗中，E．maxima是不可缺少的虫种 抗原差异而导致免疫效果不佳，甚至失败。本实验室前期研究发现，巨型艾美球 strain)和南通株(NT 虫上海株(SH strain)在免疫原性方面存在着显著的差异， 即上海株仅对同源株攻击产生免疫保护力，而南通株对同源株与异源株攻击均能 产生免疫保护力。为了探索这两株球虫在免疫原性上差异的分子基础，本文开展 了下列研究工作。 1E．maxima 用常规方法分别从E．maximaSH株和NT株未孢子化卵囊中提取总RNA，并 交和两轮抑制性PCR后，将PCR产物连接pGEM．TEasy载体，并转化到大肠杆 菌感受态细胞DH5a，经过蓝白斑筛选，分别构建了2个抑制性消减文库。随机 从两个消减文库中挑取阳性克隆，用接头引物nest l和nest 2R进行 primer primer SH株和E．maxima PCR扩增，经PCR鉴定显示E．maxima NT株未孢子化卵囊消 扬州人。Z硕十：学位沦文 kb～1．0 段大小分布在O．25 kb之问。 2E．maxima 达基因的筛选与分析 首先，用地高辛标记方法制备了4种探针，即SH株消减组cDNA探针、SH 随后，分别用同源株消减组探针和异源株未消减组探针对同一克隆进行检测，筛 选差异表达克隆。在被检测的515个克隆(SH株284个，NT株231个)中，共 可能为新基因；NT株的4个contigs中3个见有同源序列，1个未见同源序列， 可能为新基因。最后，选取6个差异表达基因，根据其序列分别设计引物，进行 的6个差异表达基因中选取2个基因，重新设计引物进行实时定量PCR验注，结 果显示这2个差异表达基因在SH株和NT株中确实存在着表达量上的差异。 关键词：巨型艾美球虫；南通株；上海株；消减cDNA文库；构建；分析 刘丹丹：巨型艾炎球虫免疫原惟相异株问消减eDNA文库的： 析 三 eDNA and ofSubtractive Construction Analysis of Differential Strains between Immunogenicity 11● ● ● EZ聊erram锻Z聊口 Liu M．S．candidate：Dan．dan Tao Advi