利用酵母双杂交技术探寻导致阿片类药物成瘾特异性胞内蛋白.pdf

利用酵母双杂交技术探，，导致阿片类药物成瘾的特异性胞内甾白 中文摘要 阿片类药物作为强效镇痛药，在临床上有着不可替代的地位。但是由 于此类药物具有耐受和依赖的缺点，不但使临床应用受到局限，更囡其成 瘾而导致滥用，给人类健康及社会文明都带来了严重危害。目前，尚未找 到有效的方法可以预防和根除阿片所导致的成瘾。这主要是因为成瘾的细 胞内制与过程不明，关键性作用靶点不清。基于目前阿片类药物成瘾机制 不明的研究现状，本论文选择酵母双杂交系统为技术平台，以阿片u受体 胞内部分作为诱饵，寻找细胞内与受体有特异性作用的蛋白质，以期对受 体后调节机制进行进一步探讨。 在双杂交系统中，选择阿片u受体c末端作为诱饵，以吗啡成瘾大 鼠脑cDNA作为待筛选文库。以阿片u受体全长序列为模板，扩增得到 长度约为200bp的片段，经测序与同源性检索，确定扩增片段序列与u受 体c末端完全一致。而后c末端片段与载体pGBKT7分别经＆oR厶Bd朋日 ，酶切，而后连接构建重组质粒。利用小规模酵母双杂交法，检测诱饵载 体的自转录活性与细胞毒性，结果表明以c末端作为诱饵，对酵母细胞 无毒性，也没有自身激活报道基因的功能。 从临床应用与滥用趋势分析，在u受体激动剂中，吗啡是最常见的药 物之一。长期给用吗啡，建立起大鼠吗啡成瘾模型。提取大鼠全脑RNA， 并以其为模板经反转录、LD—PcR最终获取双链cDNA。将cDNA与载体 pGBKT7．Rec连接，而后转化AHl09，于选择性培养基SD／一Leu上培养， 三天后，平板上长出直径在1．3mm的菌落，刮取菌落收集后组成待筛选 文库。 将不同交配型的酵母菌株Y187(诱饵)与AHl09(待筛选文库)进 行交配，交配混合液涂布于不同选择培养基上，经多次筛选后利用改良酵 母菌落PCR对阳性克隆进行大规模扩增，对相同带型的克隆进行简并。 优先选择长度在1kb左右的片段，进行凝胶回收后进行测序。 序列信息经整理合并后，得到49种基因片段序列，其中从吗啡成瘾 大鼠脑cDNA中，初步筛选得到三种编码功能蛋白的基因，分别为编码 中文摘要 富含脯氨酸蛋白(PRP)，编码胆碱乙酰化酶基因，编码一类45KD的分 泌蛋白，有资料表明前两种蛋白可能参与受体体内信号传导过程，其与受 体生物相关性的确定尚需进一步通过实验来验证。 关键词：阿片u受体；酵母双杂交系统；吗啡成瘾：胞内特异性蛋白； 胆碱乙酰化酶；分泌蛋白 利用酵母双杂交技术探寻导致阿片类药物成瘾的特异性胞内蛋白 the interceUular Screeningspecific proteins with addiction interacted opioid Abstract isa health ofme major af兜ctinglargesegments DrugdepeIldence problem mechanismswhich ofabusec锄create drugs society．Yet，the by particular remainedelusiVe． inhumanhave dependence Several memodshavebeen tobetterunderstandthe screening developed o