人TCP11a、ZNF313基因在大肠杆菌中蛋白表达与在小鼠和人睾丸中免疫组织化学的分析.pdf

人TCP11a,ZNF313基因在大肠杆菌中的蛋白表达及其在人和小鼠 皋丸中的免疫组织化学分析 摘 要 精子形成过程一般分为三个不同的阶段，1)精原细胞通过有丝分裂快 速扩增;2)精母细胞通过减数分裂形成精细胞，在这一过程中伴有同源染 色体的配对和交换;3)精细胞变形成为精子。在这三个过程中，有许多辜 丸特异和非特异基因次第表达，并在生精过程中发挥着重要作用。 四川大学华西医院医学遗传室近年来致力于男性不育相关基因的克隆 及功能研究工作，并取得了一些进展。通过消减杂交，mRNA差异显示等技术， 克隆了多个可能与男性生育相关的新基因，如ZNF230,ZNF463.ZNF313及 TCP11等。这些基因基本上在辜丸组织中均有高表达或特异表达。日前该实 验室正运用酵母双杂交、基因敲除、RNAi等多种方法研究这些基因的功能。 为了在蛋白质水平研究这些基因在翠丸组织的表达情况，我们将TCP11 基因和ZNF313基因克隆到大肠杆菌中进行表达，并利用表达的蛋白制备抗 体，进行组织化学分析，以期了解这些基因在皋丸组织中的表达状态，对其 功能进行进行推测。 第一部分:人受精促进肤受体TCPlla基因的蛋白表达及细胞组织分布 人TCP11基因编码人受精促进肤受体，该基因存在多个剪切体。我们 选择剪切体TCPlla基因进行表达，制备抗体以研究TCP11蛋白在翠丸及精细 胞上的分布 通过PCR等分子克隆技术，我们将TCPIla基因克隆到pBV220表达载 体上，通过DNA测序及表达产物的N一端测定证实了克隆基因表达产物的正确 性。然后我们还对工程菌TCPIla蛋白的表达条件进行了研究，使TCPIla蛋 白在工程菌中高效表达。并利用表达蛋白制备的抗体进行了组织化学分析。 结果显示:TCPll蛋白在鼠肇丸组织中分布具有细胞特异性，即它仅见于长 形精子细胞的细胞质中和细胞膜上，而在精原细胞、精母细胞、支持细胞、 间质细胞和精子的细胞核中均未观察到。这提示TCP11基因可能在精子的最 后成熟时期才发挥作用，并对精子形态及其生理功能有亚要作用。对.9台男 性成熟精子的荧光标记结果显示，TCPll蛋白主要分布于精子的项体和尾部， 该结果与鼠TCPll蛋白在其精子表面分布结果基本一致。 在上述工作基础上，运用生物信息分析方法，对TCPII基因及TCPIla 蛋白进行了深入分析。将人TCPll基因与小鼠、大鼠、鸡及猩猩的同源基因 进行了同源性分析，包括比较各外显子和内含子的保守性，结果发现在TCP11 基因上游约 30k6的范围内有许多保守的非编码序列，它们很可能是调控 TCPll基因特异性表达的增强子或其他调控元件。对其中最保守的一个非编 码序列进行共有调控因子结合位点预测的结果，发现该序列内存在较多的重 要调控因子的结合位点。对人TCPll基因的CPG岛分析发现在人TCP11启动 子区周围存在的一个CPG岛，同样存在于大鼠、小鼠。启动子区CPG岛的甲 基化和去甲基化可能参与了TCPll的转录调控。对TCPI1a蛋白的二级结构 预测的结果发现，该蛋白结构十分特殊，二级结构中仅有a一螺旋结构。它 有较多的潜在的翻译后修饰位点，特别是不同类型的磷酸化位点。对TCPll 基因和蛋白质结构的分析有助于了解它们的功能。 第二部分:人精子发生相关墓因ZV313在大肠杆菌中的克隆表达及组 织分布 锌指蛋白是一类广泛存在十动植物及人类的DNA结合蛋白。由于能选 择性地结合各种DNA和RNA序列，它们在基因的表达调控中起着十分重要的 作用。C2H2和C3HC4锌指是较为常见的两种锌指结构域，但很少同时存在于 同一个锌指蛋白。而我们克隆表达的ZNF313蛋白却同时含有这两种结构域。 利用PCR方法，将人ZNF313基因克隆到PET-32(a)载体上，使之以融 合蛋白形式表达。在DNA序列测定、蛋白N-端序列测定证实了克隆表达的正 确性后，我们对工程菌发酵条件、蛋白纯化条件进行了研究，并利用纯化的 ZNF313蛋白制备抗体供人攀丸组织切片组织化学分析。免疫组化分析显示在 精原细胞、圆形精子细胞、精母细胞的细胞核中出现，而Sortoli细胞、精 子细胞中未呈阳性反应。这表明ZNF313基因在辜丸特定细胞类型的特定阶 段中进行表达，并提示它在生精过程中可能发挥重要作用。 对ZNF313蛋白和基因的生物