苏云金芽胞杆菌酪氨酸酶基因克隆、表达应用初探.pdfVIP

摘 要 酪氨酸酶基因(met)编码的酪氨酸酶是生物体合成黑色素的关键酶。该酶催化底 物L一酪氨酸形成L一多巴，并经一系列氧化过程合成黑色素。黑色素具有多种重要的生 理功能，特别是其抗紫外线，清除自由基的功能和应用价值倍受关注。 由前人的研究结果已知苏云余芽胞杆菌(Bacillus 条件下产生可溶性棕黑色黑色素的基础上，首先对我室保藏的近120余株苏云金芽胞杆 菌，其中包含约80个亚种和血清型，进行了产黑色素的普查。结果表明，约50％测试 菌株均在酪素培养基42。C高温诱导下产生黑色素，产生黑色素的时间和浓度随菌株不同 而有所差别。 在NCBI网站上比较已克隆的各种生物酪氨酸酶蛋白质氨基酸序列，得到其保守结 8)，将该区段氨基酸序列在部分已测序的蜡状芽胞杆菌 构域的区段(编号pfam00264 列。由于有人将苏云金芽胞杆菌和蜡状芽胞杆菌已报道的基因序列进行比较发现二者的 相似性高达98％，因此根据该2．5 thuringiensis d，所得到的转化子EMBll79在添加了O．1％L．酪 pBMBll79。将它转入大肠杆菌DH5 氨酸的LB培养基中37℃培养16小时后能明显合成可溶性的黑色素。将如上条件下培 子量大小一致的约28．5KD的特异蛋白质条带。 测定重组菌株EMBll79．要色素的产生随时f可变化曲线。结果表明，黑色素在菌体 培养前6h内生成量不大，在6-18h内生成量逐渐增大，到18h达到峰值。与此同时， 将EMBl 的大小，断定该reel基因产生的黑色素确实能在一定程度上保护菌体免受紫外辐射。 利用PCR片段重叠延伸连接技术(SOE)，将苏云金芽胞杆菌酪氨酸酶基因的编码 区前端加上苏云金芽胞杆菌芽胞非依赖型强启动子pr03Aa，通过扩增引入的勋^I和SacI ℃酪素培养基中，重组菌重组菌BMBPM已经能够合成黑色素，但其生成量并没有提高。 SDS—PAGE结果表明，酪氨酸酶基因确实已经表达。推测可能是由于细胞内的阻遏效 应或30℃低温抑制了酶活所致。 ， 关键词：酪氨酸酶基因， 黑色素， 苏云金芽胞杆菌， 克隆 Abstract isencoded Tyrosinase，which the inthe by Tyrosinasegene(reel)，is keyenzymeprocess ofmelaninformationin and thelastfew has animals，plants microorganisms．In years，there been interestsinmelaninbecausesome growing ofits functionshavebeen important the ofanti-irradiationofUVand free recognized．especiallyability radicals． removing Basedon research、Bacillus knowntO previous thuringiensis(Bt)is diffusible