《MxA基因修饰的鸡精原干细胞体内移植获得转基因精子 Generation of Transgenic Sperm by the Transplantation of Chicken SSCs Modified with MxA Recombinant Lentivirus》.pdfVIP

2013年麓49橼第19期 AnimalScienceand 基因修饰的鸡精原干细胞体内移植 获得转基因精子 刘 莉p，何湃z一，采克俊2，张易祥2，曹访2，李景芬2 (1．浙江省淡水水产研究所，浙江湖州31300；2．湖州师范学院生命科学学院，浙江湖州313000； 3．苏州大学生命科学学院．江苏苏州215006) 摘 要：本实验旨在探讨鸡精原干细胞(SSCs)经体外遗传修饰后移植获得转基因精子的方法。将人抗病毒基 d后作为无生 因MxA重组慢病毒体外感染鸡SSCs，获得可表达MxA的SSCs；同时将80日龄公鸡经白消安处理30 精能力的受体鸡。MxA基因转染后的SSCs移植到受体鸡，10d后开始采精，经PCR检测精液DNA中的MxA基因； 取移植后10d的睾丸组织分离培养并检测外源基因表达。结果表明：MxA重组慢病毒感染SSCs后，可见其特征 性荧光表达：白消安处理后的受体鸡睾丸组织曲细精管中内源性生精细胞已基本去除；实验组有1只受体鸡的 精液DNA连续4次扩增出MxA特异性片段：睾丸组织细胞的RT—PCR及免疫组化均检测到MxA基因的表达。结果 显示，重组慢病毒感染后的SSCs能成功移植至受体组织，并继续分化为携带MxA外源基因的精子。本研究为下 一步通过人工授精获得抗病毒转基因鸡奠定了良好基础。 关键词：SSCs；MxA；慢病毒载体；移植；转基因精子；鸡 中图分类号：$831．2 文献标识码：A 文章编号：0258—7033(2013)19—0081—05 动物转基因技术是指将外源基因导入动物细胞 在体外对SSCs进行培养和转基因操作，再进行移植， 内，使之在宿主基因组中整合，并能稳定遗传给后代 分化发育后获得转基因精子，便可用于生产转基因 的生物技术，可应用于动物的品种改良、创建动物疾 动物。本研究将具有抗禽流感病毒的人MxA基因在 病模型、药物生物反应器等多个领域。由于禽类生 体外转染SSCs．获得基因修饰的SSCs再移植到经白 殖系统和胚胎发育的特殊性，与哺乳动物相比，其转 消安处理去除生精能力的受体公鸡睾丸组织，并在 基因技术研究相对滞后。将生殖干细胞与转基因技 受体睾丸组织中继续分化发育得到转基因精子，为 术相结合是动物转基因技术的又一发展方向。精原 进一步转基因鸡的制备奠定基础。 干细胞(SSCs)是存在于曲精细管基膜上、具有自我 1材料与方法 更新并能定向分化直至产生精子的一类成体生殖干 细胞。与造血干细胞类似，SSCs同样具有可移植性， 1．1 实验动物 本研究所用2013龄及80日龄广西 将SSCs移植到去生精能力的受体曲细精管内，可发土鸡均购自浙江湖州广东温氏畜牧有限公司。按照 常规饲养管理。 育为精子。Brinster等[1_2】首次报道将可育小鼠的含 SSCs的混合生精细胞移植到无生育能力的小鼠睾丸1．2主要试剂 高糖DMEM培养基、胎牛血清(FBS) 曲细精管内，产生了精子，并得到供体后代。SSCs成均购自Gibco公司；胶原酶、胰蛋白酶、牛成纤维细胞 功移植需要为其提供定植空间——“龛位”，即需要 去除受体原有的生精能力。受体制备主要有2种方 法．一种是直接利用内源性精子发生缺陷的动物作 为受体，另一种制备方法是采用辐射或化疗剂如白 碘化丙锭(PI)、L一谷氨酰胺、丙酮酸钠、口一巯基乙醇 消安人为清除受体的精子发生【31。如果移植前直接 收稿13期：2012—10—08：修回日期：2013—02—26 AKP试剂盒购自华美生物工程有限公司；DNA 资助项目：国家自然科学基金项目；浙江省钱江人才 marker 计划项目(2012R10076)