丁苯酞对缺氧致PC12细胞损伤保护作用比较蛋白质组地研究.pdf

中文摘要 丁苯肽对缺氧致PCI2细胞损伤保护作用 的比较蛋白质组研究 摘 要 目的：缺血性卒中是最常见的一种脑血管疾病，死亡率和致残率 均较高，严重危害人类的健康和生活质量。其病理机制在于，供应脑 部血液的颅外或颅内动脉发生闭塞性病变，使局部脑组织的代谢需 求与血液供应之间发生不匹配所致脑组织缺血缺氧的一系列病理变 化，包括：细胞能量代谢异常、酸中毒、钙失稳态、自由基毒性、炎 症反应等。丁苯酞可增加缺血区脑血流量，改善全脑缺血后脑的能量 代谢和脑缺血区微循环，抑制炎症反应和钙内流，保护线粒体功能， 减轻神经功能的损伤程度，缩小局灶性脑缺血后的梗死灶等，对缺血 性卒中具有较佳的治疗保护作用。已有不少研究从不同角度对丁苯酞 的作用机制进行了阐述，但目前尚未见到蛋白质组学层面的研究。系 统了解药物治疗过程中特异的蛋白质变化将促进个体化的药物治疗 的发展。这种变化能够被基于二维凝胶电泳和基质辅助激光解析电离 ／飞行时间质谱的蛋白质组学方法所鉴定。蛋白质组学技术已经成为 生命科学领域极其活跃的学科。比较蛋白质组学用于分析不同条件下 蛋白质组的变化和差异，发现和鉴定不同生理状态下蛋白质组的差 异，．可在蛋白质水平提供关于疾病发生和细胞代谢等过程的整体而全 面的认识。随着蛋白质组学技术和方法不断发展，将在药物作用靶点 的发现、确认和药物多靶点研究等方面起到重要的作用，并将大大提 高药物发现的效率。PCI2细胞是来源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤的细 胞系，在形态、生理、生化等方面接近神经元，同时具有神经内分泌细 胞和神经元的特性，经常被用于神经细胞死亡方式和神经毒性损害 的研究。本研究通过比较蛋白质组学技术对拟缺血损伤PCI2细胞以 及丁苯肽干预的PCI2细胞进行研究，分离、鉴定差异表达蛋白，以 期深入理解缺血性脑血管病发病机制及丁苯酞药物作用分子机制。 方法：1．制作缺氧细胞模型。利用含二亚硫酸钠(Na2S204，的无 1 血清培养基处理PC2细胞，建立细胞缺氧模型。2．丁苯肽作用于缺氧 中文摘要 损伤的PCI2细胞。MTT代谢率测定PCI2细胞活性。观察丁苯肽对 进行第一向等电聚焦电泳、第二向垂直SDS．PAGE电泳后、以考马斯 2D 亮兰R250显色。透射扫描双向电泳凝胶，所得图谱以ImageMaster Elite软件进行图像分析。将感兴趣蛋白质点从考马斯亮兰染色的凝胶 上切下，胶内蛋白质酶解。以MALDI．TOF／TOF串联质谱技术结合数 据库检索对蛋白质进行鉴定。 结果： 1、不同浓度的Na2S204对PCI2细胞存活率的影响 加入不同浓度的Na2S204后，PCI2细胞的生长受到不同程度的抑 制，细胞胞膜缺损，胞体萎缩、脱落，细胞聚集。随着浓度NaES204 的增大，细胞平均吸光度值逐渐降低。当Na2S204浓度大于等于 5mmol／L时，吸光度值与对照组有明显差异(尺O．01)。 2、丁苯酞对Na2S204损伤的PCI2细胞的保护作用 浓度的增大， 细胞平均吸光度值逐渐增加。当丁苯酞浓度大于等于 10pmol／L时，吸光度值与模型组有明显差异(尸O．01)。 3、缺氧模型组与丁苯酞干预组PCI2细胞双向电泳图谱比较 10la 缺氧模型组与丁苯酞干预组(NBPmol／L)PCI2细胞双向电 泳蛋白质点定量比较，鉴定出21种差异蛋白，其中上调15种，下调6 种。 4、质谱分析及鉴定结果 21种差异表达电白鉴定结果，上调蛋白为：ATP合酶13亚基(1．3 蛋白点)、肌动蛋白、热休克同源蛋白7l、细胞周期G相关蛋白激酶、 膜联蛋白A6、外周蛋白、假定蛋白、延伸因子l卟丝氨酸／苏氨酸蛋 白磷酸酶2A调节亚基B、过氧化物酶．2、TREA、泛素C末端水解酶L1， 下调蛋白为： V型质子泵ATP酶B亚基、 PhosphoribosylformylglycinamidineSynthas、低氧上调蛋白．1、Pirin、