《ScYLV和SrMV的PCR引物优化设计》.pdfVIP

中 国 糖 料 2012矩 ofChina 第1期 16 SugarCrops 文章编号：1007—2624(2012)01—0016—05 王洪星Ⅵ，张雨良t，罗志文bz，杨文君ttl2，刘志昕t (1．中国热带农业科学院热带生物技术研究所／农业部热带作物生物技术重点开放实验室，海El571101； 2．海南大学环境与植物保护学院．儋州571737) mosaic virus，，SrMV)为材 摘要：以甘蔗黄叶病毒(SugarcaneyeUowleafvirus，，ScYLV)和高粱花叶病毒(Sorghum Premier 料．运用DNAMAN、elilTler 5．0和Oh906．0等软件设计PCR引物，，进行普通PCK、多重PCR、实时定量 PCR反应，检验所设计引物的PCR扩增效率、特异性和有效性。归纳总结多种PCIL反应中引物设计的一般性思 路。提出启发性的方法，并将以上经验付诸实践检验；最后将研究思路概括为：针对性、实用性和一般性。 关键词：甘蔗黄叶病毒；高粱花叶病毒；PCR；引物设计；PrimerPremier5．0；Oli906．0；DNAMAN 中图分类号：$566．103；Q78 文献标识码：A 聚合酶链式反应(PCR)是体外扩增DNA的一种技术，其能够在短时间内根据极微量的模板序列扩增出大 学中最有价值的技术之一(DavidClark，2005)，随着科学技术的发展其又衍生出多种类型的相关技术，包括差 异显示PCR、实时定量PCR、巢式PCR、多重PCR和不对称PCR等(萨姆布鲁克，2002)。 PCR方法的广泛应用及其相关技术的顺利进行均离不开PCR引物的合理设计。可以说，PCR引物的合 理设计是任何PCR反应能否进行及其产物的特异性、产率高低的关键。目前许多计算机软件如Primer Premier Premier 3．0，Primer 5．0，Oligo6．0等均可用于引物的设计。但由于软件自身存在的局限性，其设计的 引物并无法满足实验者不同需要。目前最常用的是计算机辅助设计，即实验者根据PCR引物设计的原则并 结合自己的经验人工设计引物．然后选择合适的软件分析引物的合理性。 1材料和方法 1．1实验材料及软件 Green 实验用甘蔗样品采自海南两院甘蔗种植基地。Trizol(Invitrongen)，SYBR TM One-StepVer．2．0购自宝生物工程(大连)有限公司，PCR产物回收试剂盒(上海 PCR试剂盒PrimeScript 生物工程有限公司)，反转录酶、Taq酶及其它生物试剂均购自北京全式金生物科技有限公司，其它药品为国 Premier 产分析纯。Primer 5．0、Oli906．0、DNAMAN等软件于http：／／www．bio—soft．net下载。 1．2 甘蔗总I斟A提取和RT—PCR dd 解于1001上LH20中，取41xL 值．计算OD260／280的比值并用1．2％的普通琼脂糖凝胶电泳在约5V／cm的电压下，快速电泳检测并照相。 III反转录体系进行，PER反 以所提取的总RNA为模板，利用宝生物工程(大连)有限公司SuperScript 应按全式金公司TaqDNA聚合酶操作