实验四大肠杆菌感受态制备及外源DNA的转化.pptVIP

实验四大肠杆菌感受态制备及外源DNA的转化 实验目的 1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。 2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。 3.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。 实验原理 转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。 实验原理 转化方法：电击法、 CaCl2、 RuCl等化学试剂法 感受态细胞：处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。 转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子的受体细胞( Transformant )。 实验原理 本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态，然后与 pUC18质粒共保温，实现转化。 pUC18质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用 Apr符号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。 实验仪器 实验试剂 ? 大肠杆菌DH5α ? LB培养基， ? 0.1mol/LCaCl2溶液（预冷） ? 氨苄青霉素 pUC18质粒 实验步骤 菌株活化 感受态细胞制备 外源DNA的转化 转化率 影响转化率的因素 影响转化率的因素 * * 外源DNA导入细菌的几种方法 （1）转化（transformation) 感受态细菌捕获质粒DNA的过程 （2）转染（transfection) 细菌捕获噬菌体DNA的过程 （3）转导（transduction） 借助噬菌体把外源DNA导入受体细菌的过程 实验原理 基 本 原 理 感受态（Competence)： 细菌处于容易吸收外源DNA的状态 转化（transformation)： 异源DNA分子导入受体细胞的过程 致敏过程: 用理化方法诱导细胞进入感受态的操作 细菌处于00C,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,外援DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面,经短时间420C热激处理,促进细胞吸收DNA复合物 复苏：细菌在非选择性培养基上保温一段时间，使抗性的表型表达后再转到含抗性的选择性培养基上，长出来的菌落即为转入了外源基因的菌落 转化的确切机制还不清楚 ● 质粒DNA转化的过程 （1）吸附阶段：完整的双链DNA分子吸附于感受态细胞表面。 （2）转入阶段：双链DNA分子解链，以单链形式进入细胞，而 另一链则被降解。 （3）自身稳定阶段：外源质粒在细胞内又复制成双链环型DNA （4）表达阶段：即目的基因随质粒的复制子一起复制，并被转 录及翻译。 实验原理 抗Amp 宿主细菌 含Amp培养基 超净工作台 离心设备 台式高速冷冻离心机 恒温空气摇床 恒温培养箱 培养皿 （一）大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法） 1、从E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于2 ml LB液体培养基 中，37℃ ×250 rpm振荡培养过夜。将该菌悬液以1:100～1:50转接 于20 ml LB液体培养基中，37℃ ×280 rpm振荡扩大培养3 ～4小时 2、每组取1个1.5 ml离心管，加入1.5ml菌液，在冰上冷却2 min后，于 4℃ × 5000 rpm离心5min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行 ，且速度尽量快而稳） 3、弃上清液，加入1 ml冰冷的100mM CaCl2溶液，轻轻悬浮细菌，冰 上放置30 min 4、4℃ × 5000rpm离心5min 5、弃上清液，加入100μl冰冷的100mM CaCl2溶液，小心悬浮细菌，即 制成了感受态细菌悬液 （二）质粒DNA转化感受态细菌 1、取1 μl质粒DNA加入到100 μl感受态细菌中，轻轻混匀，冰上 放置30min 2、于42℃水浴中热休克90S，迅速取出放置冰上冷却2 min 3、向上述管中加入0.5 ml LB液体培养基，摇匀后于37℃ ×120 rpm振荡培养约45-60min （三）涂平板培养 1、取200 μl，涂布于含Amp抗菌素的LB平板培养基上（用玻璃 棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫）。 2、菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于3