【优质】SDS-PAGE电泳技术.docVIP

4.4 试剂和溶液（以下所用试剂均为分析纯级） 4.4.1 纯化水 4.4.2 A液（1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8）：称取18.17g Tris加80ml纯化水溶解，用6 mol/L 盐酸调pH值至8.8，加纯化水定容至100ml。 4.4.3 B液（30%丙烯酰胺）：称取29.1g丙烯酰胺，0.9 g N,N’-甲叉双丙烯酰胺于100ml烧杯中，加纯化水溶解，用量筒定容至100ml，待其完全溶解后用滤纸过滤，避光4℃保存。 4.4.4 C液（10%SDS）：称取 10g SDS于100ml烧杯中，加纯化水溶解，用量筒定容至100ml。 4.4.5 D液：10%过硫酸铵溶液（4℃保存有效期为3个月）。 4.4.6 E液（1.0mol/L Tris-HCl，pH6.8）：称取12.11g Tris加80ml纯化水溶解，用6 mol/L 盐酸调pH值至6.8，加纯化水定容至100ml。 4.4.7 电极缓冲液母液（5×），称取15.1g Tris，94.0g甘氨酸，5.0g SDS加800ml纯化水溶解，用6mol/L盐酸调pH值至8.3，加纯化水定容至1000ml。 4.4.8 电极缓冲液，量取200ml电极缓冲液母液，加700ml纯化水稀释，再用6 mol/L 盐酸调pH值至8.3，加纯化水定容至1000ml。 4.4.9 供试品缓冲液，称取0.303g Tris，0.189ml盐酸，4ml甘油，0.002g溴酚蓝，0.8g SDS，加纯化水定容至10ml，此溶液用于非还原SDS电泳，如用于还原SDS电泳，则再加2ml β-巯基乙醇；4℃保存。 4.4.10 考马斯亮蓝染色液，称取1.25g考马斯亮蓝R-250，250ml甲醇，50ml冰醋酸，加纯化水溶解至500 ml。 4.4.11 考马斯亮蓝脱色液，量取150ml 95%乙醇，75ml冰醋酸，加纯化水至1000 ml。 4.5 操作过程 4.5.1 制备分离胶（凝胶浓度15%） 首先检查玻璃板是否洁净，如有污垢，需重新用纯化水洗净后用吹风机吹干再用。将长短两片玻璃板相对而放，长玻璃板有间隔条的一面面向短玻璃板，两玻璃板放在灌胶框里夹紧，并确保两玻璃板下边缘在同一个水平面上，将装有玻璃板的灌胶框安放在灌胶架上。 一块胶的配方量：用移液枪取纯化水0.95ml、A液1ml、B液2 ml、C液0.04ml、D液0.025ml、TEMED 0.004ml于烧杯中，混匀，立即灌胶，并用1~1.5ml纯化水封顶端，放置约30min。 4.5.2 制备压缩胶 分离胶凝固后（观察凝胶界面应平直，否则为不合格分离胶，不能使用），倒去上层水，并用吸水纸吸干。配压缩胶，取纯化水1.4ml，B液0.33ml，E液0.25ml，C液0.02ml，D液0.02ml，TEMED 0.008ml，混匀，灌胶，并插入样品梳，放置约40min。填写凝胶配制记录（附件Ⅱ）。 4.5.3 样品处理 变性纯化：将“上样液”、“穿透液”、“洗脱液”三个样分别与还原缓冲液按1︰1、3︰1、1︰2的比例混匀，沸水浴1分钟，8000rpm×1min离心。 沉淀溶解液：将样品与还原缓冲液按1︰3比例混匀，沸水浴1分钟，8000rpm×1min离心。 复性纯化：将“上样液”、“冲洗液”、“洗脱液”分别与非还原缓冲液和还原缓冲液按1︰1比例混匀，还原性电泳样品沸水浴1分钟，8000rpm×1min离心，非还原性电泳样品沸水浴0.5分钟，8000rpm×1min离心。 原液：将样品分别与非还原缓冲液和还原缓冲液按1︰2比例混匀，还原性电泳样品沸水浴1分钟，8000rpm×1min离心；非还原性电泳样品沸水浴0.5分钟，8000rpm×1min离心。：将样品分别与非还原缓冲液和还原缓冲液按1︰2比例混匀，还原性电泳样品沸水浴1分钟，非还原性电泳样品沸水浴0.5分钟。4.5.4 加样 待浓缩胶聚合后拔出样品梳，将电泳缓冲液注满电泳槽，在加样孔中加入4.5.3所处理的样品，原液上样量为10~15 μg，变性纯化中“上样液”、“穿透液”、“洗脱液”分别为20μg、20μg、10μg，沉淀溶解液上样10μg，复性纯化中“上样液”、“洗脱液”上样量15μg，“冲洗液”1μg左右，若“冲洗液”无蛋白则用非还原缓冲液代替。 4.5.5 电泳 接通电源，一块胶：以恒流30mA开始电泳，至待检样品进入分离胶后将电流调至60mA，直至电泳结束；两块胶：以恒流60mA开始电泳，至待检样品进入分离胶后将电流调至120mA，直至电泳结束。 4.5.6 染色 电泳结束后将玻璃板取出，用纯化水将电泳槽冲洗干净，然后将凝胶取下，放入电泳染色液中，用微波炉Ⅱ档火力加热约1分钟，放在摇床上摇动约10分钟。玻璃板用纯化水充分洗净，放在架