ExoIII介导的LIC高效克隆系统的建立与载体重建.pptxVIP

Exo III 介导的LIC高效克隆系统的建立及载体重建答辩人：梁耀极导 师：韩家淮一、L I C背景经典连接克隆方法的极限：长片段进大载体难度大；酶切位点有限，受酶切位点限制大。L I CLigation Independent CloningLIC原理 带缺口和突出端的DNA复合物在细菌中能被 有效地修复载体和目的片段间，只要带有足够长的同源粘性末端（8bp），经退火，转化E.coil. 即可获得完整的质粒DNA获得粘性末端ExoIII 全名 Exonuclease III(核酸外切 酶III)，其具有3’=5’的外切酶活性获得5粘性末端获得粘性末端ExoIII 全名 Exonuclease III(核酸外切 酶III)，其具有3‘=5’的外切酶活性：具有从平末端消化dsDNA的外切酶活性；具有从5‘突出端消化dsDNA的外切酶活性；不具有从3‘突出端消化dsDNA的外切酶活性。获得5粘性末端用ExoIII处理具有同源序列的载体和片段：InsertVector(overlap)(overlap)ExoIIIInsertVectorAnealingInsertVector在用ExoIII处理载体和片段，获得粘性末端的同时势必会出现两种不可避免情况：1.InsertVector(cohesive are different in length)InsertVectorGap2InsertVector(cohesive are different in length)OverhangInsertVector获得同源序列用带同源序列的引物对目的基因进行扩增， 即可获得带同源序列的目的片段和载体。GeneGeneVector引物我们最关注的问题是：采用ExoIII是否能进行高效的克隆？二、实验过程用ExoIII进行处理，能够达到高效克隆的目的PET 28a 100ng 4ul15h+Exo III 20units 室温 5minGene-A3 100ng 1ul 转化、涂板5 个克隆10ⅹExo Ⅲbuffer 1ulDdw 4ul寻求适合的条件来延长ExoIII处理的时间条件优化一4℃,60 minutes条件优化二25-50ng 载体和片段条件优化三Insert/Vestor≧2/1最高效的克隆条件用ExoIII（20units）处理含目的片段和载体的反应体系；4℃ 下反应1h；保证目的片段和载体的浓度在25-50ng之间；保证目的片段和载体的摩尔比在2/1左右。最高效的克隆条件用ExoIII（20units）处理含目的片段和载体的反应体系；4℃ 下反应1h；保证目的片段和载体的浓度在25-50ng之间；载体重建 pBKSpcDNA3.1pcDNA6pBOB-CMV通用序列：（No-tag CS1.0）Kpn ICla IEcoR IEcoR VBgl IIBamH IHpa IGGT ACC ATC GAT GAA TTC GAT ATC AGA TCT GGA TCC GTT AACN-terminalXba IStu IXho IHind IIISma ISal ISac IAGG CCT TCT AGA CTC GAG AAG CTT CCC GGG TAG GTC GAC GAG CTC C-terminal经改造的载体都带上了共有的序列我们所获得的带通用序列的载体：pBKS-CSpcDNA3.1-CSpcDNA6-CSpBOB-CSpBKS-N- FlagpcDNA3.1-N-FlapcDNA6-N-FlagpBOB-N-FlagpBKS-N-HApcDNA3.1-N-HApcDNA6-N-HApBOB-N-HApBKS-N-MycpcDNA3.1-N-MycpcDNA6-N-MycpBOB-N-MycpBKS-C-FlagpcDNA3.1-C-FlagpcDNA6-C-FlagpBOB-C-FlagpBKS-C-HApcDNA3.1-C-HApcDNA6-C-HApBOB-C-HApBKS-C-MycpcDNA3.1-C-MycpcDNA6-C-MycpBOB-C-Myc仅需要用同一对引物对目的基因进行PCR即可同时将其接进不同的载体，并带上不同的tag三、总结优点：高效、快速、稳定；不必担心阅读框是否会改变；无痕连接(seamless); 利于多片段同时连接；经改造的载体间具有极大的兼容性。致 谢 感谢韩家淮老师、林圣彩老师、周化民老师和李勤喜老师的悉心教导； 感谢郑敏的耐心指导和实验室所有师兄师姐的指点和鼓励； 感谢本年级和我一同探讨进步的兄弟姐妹 最后感谢小杰对我始终如一的直持。谢 谢！