蛋白质间相互作用及研究方法--技术流.docVIP

蛋白质间相互作用研究方法--技术流.txt吃吧吃吧不是罪，再胖的人也有权利去增肥！苗条背后其实是憔悴，爱你的人不会在乎你的腰围！尝尝阔别已久美食的滋味，就算撑死也是一种美！减肥最可怕的不是饥饿，而是你明明不饿但总觉得非得吃点什么才踏实。蛋白质间相互作用研究方法 确定各种可能与目标蛋白相互作用的蛋白质 .. 双杂交和其他双成分系统 第一阶段：诱饵-LexA融合蛋白的鉴定 诱饵-LexA融合蛋白的构建 1．将编码诱饵蛋白的靶DNA克隆到LexA融合载体的多聚接头处，以合成一种框架内的LexA 融合基因。确定诱饵序列的羧基端存在翻译终止序列。形成的质粒作为pBait。 2．采用下列LexA融合基因和lexAop-lacZ报道质粒的组合，建立一系列EGY48 lexAop-LEU2 选择的转化酵母菌： a. pBait + pMW12（活化测定） b. pSH17-4 + pMW12（活化的阳性对照） c. pRFHM1 + pMW12（活化的阴性对照） d. pBait + pJK101（抑制/DNA结合测定） e. pRFHM1 + pJK101（抑制的阳性对照） f. pJK101单独（抑制的阴性对照） 3．将每种转化混合物铺在适宜的选择性缺陷板上：CM(Glu)-Ura-His（针对质粒组合a~e） 或CM(Glu)-Ura（针对质粒组合f）。将培养板在37℃培养2~3天以选择含有质粒的转化 酵母克隆。 4．制备转化子的母板。 活化和抑制活性的鉴定：X-gal和Leu2表型的分析 5．从a~f的每个转化中，用无菌的平头牙签挑选约8个克隆。用干净的牙签触及克隆以挑取 细胞，使它们在新鲜的CM(Glu)-Ura-His或CM(Glu)-Ura平板上划1 cm长的线，30℃孵育 过夜。 6．第二天，从两个母板上再划线到下列每个板上： 转化a~f：划线到CM(Glu, X-gal)-Ura和CM(Gal, X-gal)-Ura上 转化a~c：划线到CM(Glu)-Ura-His-Leu和CM(Gal)-Ura-His-Leu上  7．30℃将平板孵育到4天。 8．对抑制和激活性进行分析： a. 对于抑制活性，在划线接菌12～24 h时观察X-gal表型。 b. 对于激活性，在划线接菌18～72 h时观察X-gal表型。 c. 在48～96 h之间观察Leu表型。 9．基于抑制和激活分析的结果，选择适当的候选克隆。 检测诱饵蛋白质表达 10． 在母板上，标记要分析蛋白质表达的克隆。用已证实适宜表达诱饵的克隆作为基础菌 培养，供文库转化用。 11． 对每个新的诱饵构建，至少分析两个初级转化子。还要包括两个作为蛋白质表达阳性 对照的转化子。 12． 转移1.5 ml培养液到一个微量离心管中，在离心机上以最大速度离心细胞3～5 min。 可见沉淀的体积2～5μl。小心倾去或吸除上清。 13． 加入50μl的2×SDS凝胶加样缓冲液到离心管中，快速振荡离心管以悬浮沉淀。立 即将离心管放在干冰上或干冰/乙醇浴中。 14． 将样品从干冰或-70℃直接转到100℃，并煮沸5 min。 15． 将样品在冰上冷却并在离心机上以最大速度离心5～30秒。加20～50μl样品到SDS 聚丙烯酰胺凝胶的每个泳道中。 16． 电泳并分析产物以确定预期大小的诱饵蛋白是否以合理的水平表达。 17． 为防止可能出现的问题，通过免疫印迹来分析含LexA融合的诱饵的酵母裂解液。 第二阶段：筛选一个相互作用子 转化文库 1． 挑选一个在第一阶段的原始对照试验中状态最好的表达诱饵蛋白和lexAop-lacZ报道子 的酵母菌落，接种于20 ml CM(Glu)-Ura-His液体培养基中，30℃摇动过夜培养。 2． 稀释20 ml的过夜培养物于300 ml的CM(Glu)-Ura-His液体培养基中至OD600约为0.10～ 0.15。在旋转摇床上30℃摇动培养，直到OD600达到0.50左右。  3． 把培养物转移至1个250 ml的无菌离心瓶中，室温下1000～1500g（使用Sorvall GSA转子2500～3000 r/min）离心5 min。移去上清，加入30 ml无菌水，在工作台上轻 轻拍打离心瓶重新悬浮沉淀，转移混合物至1个50 ml的无菌Falcon管中。 4． 1000～1500 g（同上）离心酵母细胞5 min。倒掉水，重新悬浮酵母细胞于1.5 ml含0.1 mol/L乙酸锂的TE(pH 7.5)中。 5． 在30个1.5 ml的无菌小离心管中分别加入1 μg的文库DNA和50μg刚刚变形的载体DNA。马上在每个小离心管中加入50μl的酵母悬浮液。 6． 在每管细胞悬浮液