《核酸电泳技术》.ppt

核酸凝胶电泳技术（P161） 原理 类别 应用 一 基本原理 1）核酸分子中糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态；核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正电极方向迁移； 2）电泳中使用无反应活性的稳定的支持介质，电泳迁移率（或迁移速度）与分子大小、介质粘度等成反比； 因此，可在同一凝胶中、一定电肠强度下分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的核酸分子。 拍照，分析 优点与应用 优点： （1）便于分离; （2）便于检测; （3）便于回收 应用： 分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段，分子克隆技术核心技术 迁移速度影响因素 样品的物理性质：分子大小、电荷、空间构型 支持物介质 琼脂糖，0.2-50kb 聚丙烯酰胺，1-1000bp 脉冲场凝胶电泳：大片段107 电场强度 缓冲液离子强度：TAE, TBE, TPE 指示剂与染色剂 指示剂 ：溴酚蓝，二甲苯青 终止酶反应 便于加样 监视实验进行 染色剂：溴化乙锭EB 二、琼脂糖凝胶电泳 拍照，分析 影响迁移速率的因素 DNA分子的大小 琼脂糖浓度：与浓度成反比 DNA的构象：超螺旋环状＞线状＞切口环状。 4 所用的电压：与所用的电压成正比。 5 电泳缓冲液： TAE、TPE及TBE 凝胶载样缓冲液 NOTE 染色剂EB为强致癌物，见光易分解，储存浓度10ng/ml，应用棕色或铝箔纸包裹瓶保存。工作浓度0.5ng/ml。 琼脂糖凝胶电泳不能有效回收大片段和小片段DNA 聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳 聚丙烯酰胺凝胶的本质 在TEMED (四甲基乙二胺) 催化过硫酸铵还原产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺线状长链 在双功能交联剂如N，N`-亚甲双丙烯酰胺的参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成三维带状网格结构。 网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度。 种类与应用 1 变性聚丙烯酰胺凝胶 用于单链DNA片段的分离或纯化。 变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。 用途：放射性DNA探针的分离、DNA测序反应等。 种类与应用 2 非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于双链DNA片段的分离和纯化。 注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。 用途：制备高纯度的DNA片段。 脉冲场凝胶电泳 原理：两个不同方向的电场周期性交替进行，DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。 该法可分离长至5Mb的DNA分子。严格说来，应叫交替电场凝胶电泳。 影响分辨率的因素 1 脉冲时间： 2 电压： 3 电场夹角： 4 温度： 细菌转化（p163） 概念：一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状发生遗传转变的过程，又叫遗传转化。 感受态细胞：细菌转化过程中，受体细菌经物理或化学处理后，捕获DNA的能力增加。 方法： 氯化钙法：改变细胞通透性 电击法：细胞膜上点击打孔 * * 凝胶制备 1琼脂与缓冲液混合 2加热融化 3冷却65度制板 4插梳 5冷却成胶 6移梳子 点样，电泳 载样缓冲液混合 透射或入射紫外光对EB染色的凝胶成像 临上样到凝胶加样孔之前与待电泳样品相混合的一种缓冲液（溴酚蓝，二甲苯氰） 作用： 1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内； 2）使样品带有颜色便于简化上样过程； 3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。 *