大鼠脊髓中间神经元形态结构特征及对损伤敏感特异性反应的实验证实.pdfVIP

大鼠脊髓中问神经元形态结构特征及其对损伤敏感特异性反应的实验证实 大鼠脊髓中间神经元形态结构特征及其对损伤 敏感特异性反应的实验证实 硕士生： 朱亚西 导师： 雷万龙教授 学科专业：人体解剖与组织胚胎学 摘 要 神经反射通路是中枢神经系统活动的形态学基础，参与构成神经通路的神经元可分 为传入神经元、中间神经元和传出神经元三大类，中间神经元数量最多，其形态特征和 机能状态直接影响到神经系统的反射活动。神经化学的研究表明，中枢神经系统的中间 神经元含多种化学成分，包括钙结合蛋白、降钙素基因相关肽、神经肽Y、胆碱乙酰转 移酶、一氧化氮合酶等。脊髓钙结合蛋白阳性中间神经元进一步分成PV、Cr、Calb等 不同的亚群，因所含GABA递质的量和电生理特性的不同而具有不同的生理作用。形 态学研究显示，Calb阳性神经元主要分布于脊髓后角I、IIo层、Ⅶ、Ⅷ层内侧部和X 层；而PV阳性中间神经元则主要分布于脊髓灰质各种运动核团；Cr阳性神经元在脊髓 灰质II、V．Ⅷ层多见；nNOS阳性神经元除分布于脊髓后角I4II层之外，还分布于中 间外侧柱和中央管周围。综观以往研究，此领域就形态学研究而言，尚不够具体、系列 和深入。有关上述中间神经元的分布，尚未见到它们在脊髓不同区域和部位比较性观察 的完整系列的研究报道，此便是进行本实验研究的目的之一。有关脊髓灰质中间神经元 形态结构，目前可见一些组化、免疫组化、原位分子杂交、甚至电镜超微结构资料，而 设计本实验旨在结合脊髓不周部位和区域比较性观察上述阳性中间神经元的形态特征。 有关脊髓灰质中间神经元超微结构的实验研究，目前仅见几篇关于脊髓后角浅层的 PV、Calb阳性神经元的报道，而且作者也仅仅对阳性产物在细胞内的定位和阳性结构 突触连接的性质和形态学特征进行了一般性描述。而脊髓Cr和nNOS中间神经元超微 结构的实验研究目前所见甚少。如此有限的电镜超微结构资料极大地限制了对脊髓形态 结构、生理机能和病理机制的认识。为此，本实验设计借助于免疫电镜单标记技术观察 大鼠脊髓中间神经元形态结构特征及其对损伤敏感特异性反应的实验证实 接特征，为免疫电镜双标记的深入实验奠定基础。 损伤。上述钙结合蛋白相关的神经元在脊髓损伤病理过程中出现不同形式的形态学变 化；单侧神经节切除术的实验显示，后角PV阳性纤维明显减少。NO和NOS在中枢神 经损伤过程中的作用犹如一柄“双刃剑，其形态学变化也随损伤的性质、类型、程度 和时间不同而异。为了进一步证实脊髓上述4种中间神经元对损伤的敏感特异性反应， 本实验设计借助脊神经后根切断模型观察、比较和证实受累脊髓灰质不同区域上述各种 相关蛋白的表达和阳性神经元的形态学变化，为深入探讨脊髓中间神经元对损伤反应的 病理机制提供形态学依据。 材料和方法 1．免疫组化PAP方法证实脊髓中间神经元的特性、形态、数量和分布特征：借助 PV、Cr、Calb和nNOS 4种抗体进行免疫组化方法探察相应神经元在正常脊髓灰质不 同区域和不同部位的形态、数量和分布特征，以及观察证实脊神经后根切断模型中受累 证实正常脊髓灰质不同区域PV、Cr、Calb和nNOS抗原的相互共存。 2．Western 伤诱导其变化：探察并比较正常脊髓不同区域和部位上述3种蛋白的表达特征。探察证 实损伤诱导受累脊髓灰质Cr、Calb、nNOS蛋白表达的变化。 3．免疫电镜观察证实脊髓PV、Cr、Calb阳性神经元的超微结构特征：借助免疫电 镜技术探察证实上述3种阳性产物的超微结构定位，阳性结构的突触传入和传出连接的 性质和形态学特征。 4．动物模型的构建和评价：借助手术显微镜进行腰4脊神经后根切断术构建动物模 型，术后动物存活7天。在手术显微镜下切取受累脊髓，并对切片行HE和Nissel组化 染色，以证实和评价实验动物模型。 结果 1．大鼠脊髓中间神经元形态及其分布特征 (1)中间神经元的形态特征及分布规律 本实验借助特异性抗体对正常大鼠脊髓灰质4种中间神经元进行免疫组化特异性 Ⅱ 大鼠脊髓中间神经元形态结构特征