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分子杂交 分子杂交（molecular hybridization） 分子生物学中用于检测生物样本中是否含有特定的生物分子的一门技术。 分子杂交分类 Southern Blot ----DNA杂交 Northern Blot ----RNA杂交 Western Blot ----蛋白质杂交 DNA的变性（denaturation） DNA分子在某些理化因素的作用下，其两条互补链之间的氢键发生断裂，双螺旋结构松开分成两条单链。 放射性核素：核酸探针传统的标记物 优点：? 灵敏性高：0.5～5 pg 特异性高：放射自显影法? 方法简便。 ? 缺点： 半衰期短，必须经常标记探针（3H 的半衰期长达12.3年，但它所释放β放射线能量太低，只能用于组织原位杂交） 费用高 检测时间长：曝光时间1～15天 放射性同位素对人体有害，实验室和环境易被污染 非放射性标记物 优点： 无放射性污染；? 稳定性好；? 探针可长时间保存。? 缺点： 灵敏度及特异性不高。? 非放射性标记物的种类 半抗原：地高辛，利用半抗原的抗体进行免疫学检测。? 配体：生物素，是一种抗生物素蛋白avidin和链亲和素streptavidin的配体。 ? 荧光素：异硫氰酸荧光素和罗丹明，可被紫外线激发出荧光而被检测到。 光密度或电子密度标记物： 金、银。 探针设计的条件 ① 被检基因结构清楚； 放射自显影 利用放射线在X线片上成影作用来检测杂交信号 非放射性核素探针的检测 偶联反应 半抗原:通过抗原-抗体反应与显色体系偶联。 配体:亲和法与显色体系偶联：生物素-抗生物素蛋白-酶（Avidin-Biotin-Enzyme-Complex ，ABC）? BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit) Southern Blot操作流程 1、基因组DNA的提取 2、限制性内切酶切断DNA 3、电泳分离DNA片段,变性 4、将DNA转移至尼龙膜; 5、尼龙膜洗涤、固定； 6、预杂交、与探针杂交； 7、成像或显色。 5．膜的洗涤、固定 1）膜置于0.5M Tris·Cl（pH7.2）、1M NaCl中，室温浸泡15分钟，除去粘附的琼脂糖。 2）将膜平铺于一张纸巾上，室温干燥30分钟以上。 3）DNA固定：在真空烧箱或普通烘箱内于80℃烘烤0.5－2小时。 从DNA转录成mRNA RT-PCR RT-PCR是以mRNA为模板反转录合成cDNA、再以cDNA为模板进行特异性扩增，进行RNA定性或定量分析的一种方法 基因芯片（Gene chip） / DNA芯片（DNA chip）： 1995年斯坦福大学Schena M和 Brown PO等发表第一篇基因表达阵列芯片，之后国内外兴起了一股微点阵（microarrays）技术——基因芯片的浪潮。 基因芯片是将各种“探针”固定在基质上，用于检测受检的各种标记样品中与探针互补的核酸物质的变化。 原位杂交（in situ hybridization，ISH） 6.探针标记和预杂交 预杂交：将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭。 预杂交液 ：含有鲑鱼精子DNA（该DNA与哺乳动物的同源性极低，不会与DNA探针DNA杂交）、牛血清等。 southern印迹杂交实验仪器 用杂交袋封装。 每平方厘米NC膜需预杂交液0.2ml。 变性的鲑鱼精DNA置终浓度200μg/ml。 鲑鱼精DNA置沸水浴中10min，迅速置冰上冷却1-2min，使DNA变性，保持单链。 42℃水浴中温育4h。 7、杂交、洗膜 加入标记的探针DNA（预先热变性成为单链DAN分子）。 杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行，杂交过夜。 然后在较高温度下用盐溶液洗膜。离子强度越低，温度越高。 （一）将滤膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏）。（二）在暗室内，将2张X光底片放入曝光暗盒，并用透明胶代固定，合上暗盒。（三）将暗盒置-70℃低温冰箱中使滤膜对X光底片曝光（根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天）。 8、放射性自显影检测 （四）从冰箱中取出暗盒，置室温1-2h，使其温度上升至室温，然后冲洗X光底片。 Southern blot 是研究DNA图谱的基本技术，在遗传诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。 Southern blot的应用 血迹中的DNA DNA指纹分析 * Northern 印迹（Nouther