IL7IL7R促进肺癌淋巴管形成和转移的机制.pdf

·中文论著摘要· IL．7／IL．7R受体促进肺癌淋巴管形成和转移的机制 ．▲上-—釜 刖 罱 有着重要意义。卵巢癌可刺激宿主免疫细胞分泌IL．7，血清和腹腔液IL．7升高是 宿主免疫系统抗肿瘤作用的一种表现。IL．7作为一种具有潜在抗肿瘤作用的免疫 调节活性因子，其在腹水中水平升高不及血清显著，推测腹腔局部可能存在某些免 疫抑制因素。提高腹腔局部IL．7水平可对卵巢癌有治疗意义。目前IL．7在肿瘤中 的作用不一，作用机制也不清楚。 目 的 本研究探讨IL．7在肺癌中的表达，分析它们与各临床病理因素之间的关系， 揭示IL．7在肺癌细胞侵袭和转移过程中的作用机制。 实验材料和方法 一、材料 100例原发性非小细胞肺癌癌组织及癌旁正常肺组织标本均来自1980年到 2005年在中国医科大学附属一院实行手术的病人，患者术前均未接受放化疗。标 本用中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋，制成4pm切片，采用链霉素抗生物素蛋 endothelial IL一7R和血管内皮生长因子一D(vascular growth 白表达情况，微血管密度(microvessel vessel 和VEGF-D以细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性显色。光镜下每张切片选取癌细胞 5％为“+’’， Receptor)和VEGF_D的评估为：无阳性细胞为“．”，阳性细胞数S 阳性细胞数为5％．20％为“++”，20％为“斗_卜十”，其中“++”和“十H”为高表达，“．” 和“+’为低表达。血管和淋巴管判定标准为：内皮细胞形成条状、裂隙状等孤立结 构棕黄染色或有管腔者按一条血管或淋巴管计数。低倍光镜下确定3个微血管或 淋巴管高密度区域(热点)，然后在高倍镜下分别计数每个热点中3个区域的CD34 当计数相差10％以上时则重新计数。 二、细胞培养 SPC．A1和人肺鳞癌细胞系SK．MES．1。 三、逆转录．聚合酶链式反应(RT-PCR) 采用凝胶成像分析系统进行半定量分析。 ． 四、WesternBlot法 在收集的细胞内加入裂解液充分裂解，低温高速离心(4℃，12000转／rain， 抗体均购自Santa 泳凝胶成像分析仪(Chcmi Innotech，USA)采集，进行灰度值 Imager5500，Alpha 测定。 五、染色质免疫沉淀法 2 加入37％的甲醛使A549细胞内的蛋白和DNA充分交联，裂解细胞，超声剪 合物，逆转蛋白／DNA复合物交联，纯化DNA，做PCR，重复三次，取平均值。 六、免疫共沉淀法 在收集的新鲜培养的细胞中加入裂解液，充分裂解后，每管分别加入100ul c．Jun抗体，使终体积为lml，4C孵育 磁珠(MiltenyiBiotee，Germany)和20ul 30min，用蛋白裂解液冲洗u柱(Miltenyi 液冲洗，收集液体，做Westernblot，重复三次，取平均值。 七、细胞迁移和侵袭能力检测 签轻擦掉微孔膜上表面的细胞，苏木素染色，室温干燥过夜。取下微孔膜，置载 玻片上，镜下观察。细胞侵袭能力的测定用预冷的无血清培养基以1：7稀释 00ul，在室温下放置6h。使用前用培养基 Matrigel(BDBiosciences，USA)力Hfl,上室1 重新水化并吸净，其他与迁移实验相同，培养18hr后观察结果。 八、MTT法检测细胞增殖 将单个细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔含103个细胞，培养24h，每孔 bromide)溶液继续培养4h，加入 加入MT