液相及液质分析方法学的开发及验证.ppt

HPLC及HPLC/MS分析方法的开发及其在药物分析中的应用 基于分离分析科学技术 小颗粒填料的色谱柱 以光谱、质谱技术作为检测手段 专属性、分离效率及灵敏度 适用于广泛的色谱应用 适用于开发新方法 适用于现有方法的改进 系统适用性试验的内容 在分析未知样品之前或期间，检查系统以保证系统之性能达到规定的要求 塔板数，拖尾因子，分离度 确定重现性（%RSD） 系统适用性“样品” 主组份与预期副产物之混合物 系统适用性试验是色谱方法的一部分 容量因子 k 2 精密度/进样重复性 RSD ? 1%, n ? 5 分离度 Rs ? 2 (主峰与最近洗脱的色谱峰之间) 类型1 主组份或活性成份定量分析方法 类型2 杂质或降解化合物测定方法 类型3 性能特点之确定分析方法 如溶出度实验 类型4 鉴别试验 分析实验阶段 按照规定的实验计划或步骤 通常需要3 到 5天 在不同操作条件下，进不同浓度的试样 原料及制剂皆需分析 数据分析阶段 对分析结果进行统计学计算 色谱结果是相对的 用统计学分析的方法，可以客观地评估最终结果的真实变化 每一方法验证的过程由80到100次分析组成 每次分析中，仅一种组分（一个色谱峰）即可产生7个相关结果（峰面积，保留时间，分离度等……） 每一组分最终得到总共约700 个数字 所有这些数字需要进行数学处理： 手工处理（计算器，Excel Macro’s 等） 专用的方法验证程序 传统型C18硅胶柱上金属杂质对碱性化合物峰形的影响 丧失浸润现象：100%水溶液中保留完全丧失 优点 单位时间的分离能力增加－较大的峰容量 检测灵敏度提高 缺点 仪器设备要求高 不适合某些检测方式 色谱柱需再生 定量分析的重复性较低 高压梯度及低压梯度 滞后体积太大会引起梯度变化的延迟 例如：滞后体积为 2.0ml，流速1.0ml/min时梯度晚2分钟 如流速为0.1ml/min，实际梯度晚20分钟 滞后体积的不同会使方法转换麻烦 滞后体积比文献值大或小都使方法不能重现 普通HPLC的滞后体积为2~4ml 对分析型HPLC没有影响 对作微柱实验用梯度时影响较大 液相色谱的分离机理 流动相pH值 影响带有可离子化官能团的分析物 胺 羧基 酚 有些化合物含有一个以上的可离子化官能团 改变流动相pH将使选择性发生极大改变 流动相pH值 酸性和碱性化合物在其未电离状态下时反相保留最大 中性化合物的保留不受pH影响 Silica pH Range Hybrid Particle pH Range Neue et. al. American Laboratory 1999 (22) 36-39. pH 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 2 4 6 8 10 12 Retention Factor (k) 酸性 碱性 中性化合物 碱性保留增强 [B] 酸性保留增强 [HA] 固定相、溶剂和流动相pH的影响因素 I A P Fl Fe D O Fluoro-Phenyl pH 3, MeOH P C18 pH 3, ACN I A P Fl Fe D O I A Fl Fe D O C18 pH 10, ACN Phenyl-Hexyl pH 10, MeOH I A P Fl Fe D O Test Probes: I: Imipramine [B] A: Amitriptyline [B] Fl: Flavone [N] O: Octanophenone [N] 碱性及中性化合物 固定相、溶剂和流动相pH的影响因素 I A P Fl Fe D O Fluoro-Phenyl pH 3, MeOH P C18 pH 3, ACN I A P Fl Fe D O I A Fl Fe D O C18 pH 10, ACN Phenyl-Hexyl pH 10, MeOH I A P Fl Fe D O Test Probes: P: 1-pyrenesulfonic acid [A] Fe: fenoprofen [A] D: diclofenac [A] 酸性化合物 固定相、溶剂和流动相pH的影响因素 分析物在其未电离[中性]状态时保留较强 甲醇的洗脱能力较乙腈弱，因此所有化合物的保留都会得到增强，同时也具有不同于乙腈的选择性 当流动相pH值能改变分析物的带电状态时，能得到选择性的极大改变 在任一条件下，使用不同固定相时，能获得大的选择性改变 最显著的选择性差异在于将固定相、溶剂和流动相pH因素综合时 梯度洗脱 梯度洗脱 溶剂 A 溶剂 B 泵 A 泵 B 混合器 A 高压梯度 溶剂 A 泵 溶剂 B 比例阀（溶剂混合点） 混合器 B 低压梯度 （溶剂混合点） 梯度洗脱滞