酶工程 第八章 酶固定化 2013-2.ppt

第八章 酶固定化 酶固定化定义 酶固定化（enzyme immobilization）是将酶固定在载体上，制备固定化酶的技术过程。 固定化酶(immobilized enzyme)：固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。 酶的优缺点 固定化酶研究历史 (1) 1916，Nelson和Griffin发现蔗糖酶结合于骨炭末上仍具有活力，但未引起人们重视。 (2) 1953，Grubhofer和Schloith将聚氨基聚苯乙烯树脂重氮化后与淀粉酶、蛋白酶结合——最早固定化酶 (3) 60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。 (4) 在1971年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定化酶的统一英文名称为Immobilized enzyme。 (5) 随着固定化技术的发展，出现固定化菌体 。1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。 (6) 在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了固定化细胞技术。 1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生产淀粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。 (7) 1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸，取得进展。 固定化酶的优点 增加酶稳定性，可反复或连续使用，提高使用效率，降低成本 易于和反应产物分开，产物溶液无酶残留，简化提纯工艺 酶反应过程可严格控制 较游离酶更适合多酶反应 增加产物收率，提高产物质量 第一节 固定化方法 固定化方法（immobilization method） 吸附法 包埋法 交联法 热处理法 一、吸附法(Adsorption) 利用各种固体吸附剂将酶或细胞吸附在其表面上，而使其固定化的方法称为物理吸附法，简称吸附法。 常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、硅胶、羟基磷灰石、多孔塑料、金属丝网、微载体、中空纤维等。 优点：操作简便、条件温和、不易变性失活、载体廉价、可反复使用。 缺点：酶与载体结合不牢固，易脱落。 酵母细胞——多孔陶瓷、多孔塑料——酒精、啤酒发酵 活性污泥微生物——硅藻土、多孔玻璃、多孔陶瓷、多孔塑料——废水处理 霉菌——多孔塑料、金属丝网——生产有机酸、酶 植物细胞——中空纤维——色素、香精、药物等 动物细胞——容器壁、微载体、中空纤维——功能蛋白质等药物 二、包埋法(Entrapment) 将酶、细胞或原生质体包埋在各种多孔载体中，使其固定化的方法称为包埋法。 包埋法优缺点 包埋法分类 凝胶包埋法 网格型：将酶包埋在高分子凝胶细微网格中。 半透膜包埋法 微囊型：将酶包埋在高分子半透膜中。 1. 凝胶包埋法 以各种多孔凝胶为载体，将酶、细胞或原生质体包埋在凝胶的微孔内的固定化方法称为凝胶包埋法。 适用于多种酶、微生物、动植物细胞及原生质体 不适用底物或产物分子很大的酶类。 载体 琼脂 海藻酸钙凝胶 角叉菜胶 明胶 聚丙烯酰胺凝胶 （1）琼脂凝胶包埋法 缺点 琼脂糖凝胶的机械强度较差 氧气、底物和产物的扩散比较困难 应用受限 （2）海藻酸钙凝胶包埋法 （3）角叉菜胶包埋法 carrageenan 角叉菜胶包埋法优点： 具有一定的机械强度；可用戊二醛等进行双重固定化 对酶、细胞、原生质体无毒害 通透性较好，是一种良好的固定化载体 应用广泛 （4）明胶包埋法 gelatin 明胶悬浮液→加热融化→高压蒸汽灭菌→冷却至35℃以上→与酶（细胞、原生质体）混合→冷却→所需形状。 明胶是一种蛋白质，易受蛋白酶的分解，不适用于蛋白酶及生产蛋白酶的细胞、原生质体的固定化。 （5）聚丙烯酰胺凝胶包埋法 polyacrylamide gel 优点： 机械强度高 适用于多种细胞和酶的固定化 缺点： 丙烯酰胺单体对细胞有一定的毒害作用，应尽量缩短聚合时间 （6）光交联树脂包埋法 在光的作用下分子间发生交联反应，生成不溶性网状聚合物——光交联树脂 作用原理：在一定波长的光引发下，带有可以发生光交联反应官能团高分子之间发生加成性交联聚合反应，生成不溶性交联产物 为了增加光敏感范围，此类树脂在使用时有时需要加入光敏化剂 固定过程 特点： 不同分子量的预聚物形成不同孔径的树脂，适合多种不同直径的细胞固定 光交联树脂的强度高，可连续使用较长的时间 用紫外光照射几分钟就可完成固定化，时间短 对细胞的生长繁殖和新陈代谢没有明显影响 使用的多孔载体及其特点 2. 半透膜包埋法 半透膜包埋法是将酶或细胞包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶或固定化细胞。也称微囊型包埋法（microencap