实验一抗血清制备.pptVIP

Contents 动物免疫血清制备技术 吉林大学人兽共患病研究所 概念 免疫原的制备 免疫动物 免疫血清的纯化 免疫血清的鉴定 免疫原—天然抗原、人工或合成抗原； 蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原； 具体制备： 细胞性抗原、可溶性抗原、半抗原 佐 剂 是一种非特异性免疫增强剂，预先或同抗原一齐注射到机体，能增强对该抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型，此种物质被称为佐剂（adjuvant）。 一、种类 1.无机佐剂 氢氧化铝、明矾 2.有机佐剂 微生物极其代谢产物 3.合成佐剂 多聚肌苷酸、胞苷酸 4.弗氏佐剂 不完全佐剂、完全佐剂 5.新型佐剂 C3d、Cpg基序、脂质体 三、免疫动物 1、免疫动物的选择： ①抗原来源与动物种属的关系（越近越差） ②动物个体的选择（年龄、体重与健康，性别） ③抗原性质与动物种类 ④抗血清要求：R型 能和很小量抗原结合形成沉淀线 H型 较少用于沉淀反应。 三、免疫动物 2、免疫的方法： 免疫原的剂量 抗原性的强弱、分子量大小、动物的个体状态和免疫时间。 细胞性抗原： 羊：108；兔：107；小鼠：106。 佐剂：附近或对侧，或者先注射佐剂，再注射抗原。 以免破坏细胞，影响免疫效果。 可溶性抗原： 小鼠：50～100μg；大鼠：100～200μg；兔：100～1mg，合成免疫原为2mg；半抗原：20～200μg /次 与佐剂混合 三、免疫动物 2、免疫的方法： 免疫的途径与其间隔时间 三、免疫动物 2、免疫的方法： 免疫动物采血 颈动脉放血法 心脏采血法 断尾采血 眼球采血 静脉多次采血法 免疫血清的鉴定 1、抗体效价的测定（凝集、扩散、ELISA） 2、特异性的鉴定（免疫印迹、双扩散） 3、纯度的鉴定（SDS-PEAG） 4、亲和力的鉴定—affnity指抗体与抗原结合 的牢固程度，以亲和常数表示。 测定方法有平衡透析、ELISA、竞争（非 竞争）结合等。 四、免疫血清的保存 1、4℃保存（6个月） 2、低温保存（-70 ℃ ～-20 ℃ ，5年） 3、真空干燥保存（5 ～ 10年） 注意点：保存前需经除菌 保存液含防腐剂 避免反复冻融（分装） 实验一、 BSA抗血清制备 目的要求：掌握免疫原和佐剂的制备方法；熟悉免疫血清制备的基本过程。 原理：将抗原物质经适当途径，按照预先制定的免疫方案免疫动物，经过一定时间，可刺激机体产生高效价特异性抗体并分泌到血液中，当血中抗体达到预定效价时便可采血，分离血清，低温保存备用，即抗血清。因抗原具有多种表位，可激活多个克隆的B 细胞活化增殖分化产生抗体，因此，又称为多克隆抗体。 优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的质量和免疫原性，动物应答能力以及免疫程序（免疫途径、剂量、注射次数、时间间隔、有无佐剂等） 材料： 动物：BALB/C小鼠 抗原：BSA（2mg/mL） 试剂：佐剂、生理盐水、75%酒精 器材：小剪刀、镊子、无菌注射器（1ML）、一次性手套，50ML离心管、酒精灯，打火机，记号笔、加样枪（1000，200，50，10ul）、吸头（1000，200，10ul），2ML离心管、250ML烧杯； 均质机（乳化抗原用） 实验一、 BSA抗血清制备 方法 1.抗原制备：BSA (2mg/mL) 配制：与佐剂等量混合，乳化30-60分钟，取一滴于冷水面上，不散开者达到“油包水”合格要求。 2. 免疫动物： 实验一、 BSA抗血清制备 BSA BSA-FIA BSA-FCA 抗原 30－50Ug 100Ug 100Ug 剂量 腹腔 腹腔/足垫 腹腔/足垫 途径 三免疫 二免 一免 免疫日期 3. 试血 尾部采血 4. 效价测定 琼脂扩散：1：16 ELISA： 1：2000 5.采血：眼球采血、心脏采血 6.分离血清： 一般采血后放37摄氏度一小时，然后放4度过夜。血清较少时可以离心 （1500~3000 rpm，10分钟） 实验一、 BSA抗血清制备 * LOGO LOGO 1 玻片凝集实验+二免疫 2 琼脂免疫扩散试验+三免疫 3 4 ELISA测定 动物免疫血清制备 授课人 卢士英 2010级生物技术专业 抗原与抗体的相互作用是免疫学检测的基础，抗体作为重要的特异性免疫分子，已广泛用于科学研究、临床诊断、治疗及