马兜铃酸致血管内皮细胞损伤机制探讨及其羟苯磺酸钙的拮抗作用.pdfVIP

·中文论著摘要· 马兜铃酸致血管内皮细胞损伤机制探讨及羟苯磺 酸钙的拮抗作用 目 的 马兜铃酸肾病(AAN)是一种快速进展的肾小管间质疾病，对其发病机制的 认识尚未完全达成共识。近年来有关马兜铃酸(AA)致肾小管周毛细血管网丢失 造成小管间质缺血缺氧、小管萎缩，间质纤维化的研究有增加趋势【1】。内皮细胞 裱褙血管内壁，是血管损伤的关键靶组织，直接接受血液中有害物质毒害，承受 各种应激，内皮细胞具有多种细胞因子分泌功能，信息传递、抗凝等复杂的舒缩 调节功能，直接参与血管的形成和重塑。所以AA对血管内皮细胞(VEC)的损 伤及拮抗途径的研究，将为慢性马兜铃酸肾病(CAAN)的治疗，寻找一条新的 途径。 本实验通过体外培养人脐静脉内皮细胞系(硼JVEC)，FLuo一3钙离子探针检 栓调节蛋白(TM)，倒置显微镜及透射电镜观察细胞形态及超微结构改变。探讨 AA对VEC(【ca2+】i)的影响，并观察不同浓度的羟苯磺酸钙在不同培养时间点 对VEC钙离子稳态的影响，对VEC的保护作用。 材料与方法 一、实验材料 主要试剂：人脐静脉内皮细胞系(HUvEC)、DMEM低糖培养基、优等胎牛 铃酸钠盐(工作浓度10rag／1)、羟苯磺酸钙原粉、FLuo一3，AM59M、血栓调节蛋 压锅、冰箱、显微镜带自动显微照相装置、细胞内钙离子荧光成像测定系统。 二、实验方法 l、细胞培养 DMEM培养基中培养，37C，5％C02恒温培养箱孵育。 2、实验分组及处理 的溶液。将羟苯磺酸钙原粉加入DMEM培养基中，配置成浓度为1 0lxM、25}tM、 的DMEM培养基培养24h后，干预组再随机分三组，分别加入含上述浓度羟苯磺 酸钙的DMEM培养基中再培养24h、48h。 3、各组细胞([Ca2+】i)测定 将各组细胞分别接种于塑料培养皿中。按上述处理后，弃原培养液，每皿用 后按组进行试验。将负载FLuo．3，AM的各组细胞置于细胞内钙离子荧光成像测 定系统操作台上，37℃测定单个细胞钙荧光强度。 4、各组细胞培养上清液中TM含量测定 收集各组细胞培养上清液各100I．tl，按照TM检测试剂盒所示ELISA方法及 程序检测，每组重复6次，检测各组TM含量。 5、各组细胞形态观察 各组细胞置倒置显微镜及投射电镜下，观察总体形态、单层细胞变化及细胞 超微结构变化情况。 三、统计学处理 所有计量资料以(x士S)表示，采用SPSSl6．0统计软件进行分析，多组间样本 均数比较用方差分析。P0．05为有统计学意义。 结果 一、各组细胞(【Ca2+】i)变化 2 与AA组相比，均有一定程度的下降。羟苯磺酸钙对([Ca2+】i)的作用，其下降 趋势呈浓度依赖性，培养48h后，与培养24h的值相比，虽略有下降，但两者比 较无显著性差异。 二、各组细胞培养上清液TM检测结果 应用AA-Na屠，TM明显增多，与对照组相比，P0．05。而应用了不同浓度 的羟苯磺酸钙钙处理后，备组的TM含量均有一定的下降，羟苯磺酸钙浓度为 P0．05。 三、各组细胞形态观察结果 (一)倒置相差显微镜观察结果 对照组：细脆继壁单层生长，呈镶路石祥排列，细胞轮癣清曦，胞核为圆形 或椭圆形，细胞生长旺盛，几乎无脱落；AA组：细胞贴壁能力减弱，部分在培养 液中悬浮，贴壁缨胞体积缩小、变圆；不同浓度羟苯磺酸钙下细胞赔壁生长良好， 少有脱落。 (二)透射电镜细胞超微结构观察结果 1、电镜下各组细胞核变化情况 对照组正常细胞形态，核完整；AA组细胞核形不规则、凹陷；干预组：细胞 的核形均比较规则。 2、各组细胞胞质中内质网线粒体改变情况 对照组内质阙、线粒体正常；AA组粗藤内质网扩张呈池状，线粒体少数有嵴 缺损，空泡变性；干预组线粒体出现嵴缺损变少，粗面内质网比较完整。 妻曩结论爹匕 AA能使VEC钙超载，致内皮破坏，TM增加，内质网和