人VEGF165转基因组织工程软骨的实验的研究.pdfVIP

人vEGF。髓转基因组织工程软骨的实验研究 中文摘要 研究背景： 外伤或先天性小耳畸形致耳廓缺损患者在整形外科十分常见，而耳廓 软骨几乎无再生修复能力，目前临床上主要的治疗方法为全耳廓再造术，对手术医 师技术要求较高，且存在不同程度的并发症，如采集自体肋软骨雕刻耳支架可致胸 廓畸形，而支架可能感染、吸收、变形。人工高分子耳支架植入容易引发机体排异 反应致使支架外露发生率较高。因此，自体软骨细胞组织工程研究应运而生。尽管 已有自体软骨细胞组织工程软骨批准进入临床使用，但仅能修复体积小于lml缺损。 研究发现组织工程软骨厚度超过lmm，中心易发生“空心”现象。而这种“空 心”现象的主要原因在于软骨组织缺乏血管，细胞代谢依赖细胞外基质 (extracellular matrix，ECM)的渗透，随着外层细胞外基质不断的合成与成熟， 超过一定厚度的内层细胞因传导效率降低，发生代i身}障碍致组织缺氧和坏死。因此， 保持内层细胞增殖、存活，并维持软骨细胞生物特性成为我们实验研究的焦点。 endothelial 血管内皮生长因子(vascular factor，VEGF)，是体内重 growth 要的促血管生长因子。对成熟软骨细胞分泌表达蛋白的研究发现，软骨细胞表达一 定水平的VEGF以提高软骨细胞有丝分裂活性并促进其再分化，在软骨发生发育过 程中，对软骨细胞的存活与增殖起着重要的作用口3。运用基因工程技术，将VEGF基 因导入软骨细胞，构建VEGF强化组织工程软骨，将有利于软骨细胞存活、增殖、 分化，改善组织工程软骨内部结构。 目的：观察检测残耳软骨细胞体外扩增生物学性能。构建hVEGF螂基因载体并转染 体外培养的残耳软骨细胞，通过检测转染后软骨细胞VEGF及主要软骨ECM蛋白表 达，以分析转VEGF基因软骨细胞的生物性能，并对转VEGF基因软骨细胞体内构建 的软骨形态结构、ECM蛋白及相关基因表达进行检测分析。 软骨细胞，检测倍增时间，免疫组化，RT-PCR方法检测其产生软骨ECM主要成分能 I，COLI)，II型 type 力，包括蛋白聚糖(aggrecan，AG)，I型胶原(collagen II，COL X，COLX)。 胶原(collagentype II)，X型胶原(collagentype PCR、Western 色、免疫组化、Real—time Pluronic F～127混合，形成细胞材料复合物接种于裸鼠皮下，同时分别设立转染 rAAV2一EGFP细胞组及单纯软骨细胞组为对照组，10周后取材，组织学染色、免疫 PCR、WesternBlot等方法检测其ECM 组化比较观察三组软骨组织结构，Real—time 蛋白及与软骨细胞增殖存活相关基因表达。 表达消失，并开始表达COL 细胞，转染第3天转染效率达20．1±0．62％，并维持稳定。转染后VEGF表达延迟 期为14—21天，随VEGF表达增高，软骨细胞AG、COLII、COLX及COLI表达显著 增高。4．三组细胞一材料复合物接种裸鼠皮下10周后取材，均形成大小不一的软 骨，组织切片染色见VEGF转染细胞实验组形成均一软骨组织，软骨细胞及软骨陷 窝分布均匀，糖胺多糖及胶原纤维含量丰富，弹性纤维呈网状分布均匀，而两个对 照组软骨组织间见局部空泡样结构，糖胺多糖、胶原纤维含量欠佳，弹性纤维成条 索样分割包绕软骨细胞。免疫组化结果见三组样本均有VEGF阳性细胞，实验组分 Blot 布于软骨组织边缘，对照组散在于组织中，三组Ⅷ因子表达均为阴性。Weste