第十章第一节转基因动物.ppt

　　基因工程动物 第一节 实验动物的胚胎工程 胚胎工程是指运用人工方法对动物的胚胎及配子进行操作和改造，是改良动物品种品系，保存动物种子资源及转基因动物制备的重要手段。 主要包括四大类技术体系：胚胎移植相关技术；动物克隆技术；胚胎干细胞技术；转基因动物技术等。 一、胚胎移植相关技术 （一）胚胎移植 胚胎移植（embryo transfer）是一项难度较高的显微操作过程，是胚胎工程的重要基础。 根据胚胎发育阶段不同，胚胎移植可分为输卵管移植和子宫移植。原核胚胎到桑葚胚期的胚胎进行输卵管移植，囊胚期后的胚胎进行子宫移植。 按照操作方法,胚胎移植又可分为手术法和非手术法。小型实验动物常采用手术法，大动物常采用非手术法。 （二）排卵控制 排卵控制是通过对雌性动物采用外源激素处理，改变其性周期和排卵数来实现的。 目前常用到的激素有促卵泡激素（FSH），促黄体激素（LH），孕马血清促性腺激素（PMSG），人绒毛膜促性腺激素（HCG）。 其中FSH的生物功能是刺激卵巢中卵泡的成熟并分泌雌激素；LH也称促间质细胞激素（ICSH），其生物功能是激发排卵，促使黄体从萎缩破裂的卵泡中形成并分泌雌激素和孕激素；PMSG可以促进雌性动物卵泡的发育、排卵及黄体的形成；HCG也可促进卵泡发育和排卵。实际应用中，常把FSH和LH，HCG和PMSG配合使用，可取得较好效果。 (三) 体外受精和显微受精 体外受精（in vitro fertilization，IVF）是成熟卵细胞与经过处理的精子在体外结合而发育成合子的过程。体外受精的合子经过体外或者异种动物体内培养，再移到同种动物体内妊娠产子，由此得到的动物称为试管动物。 体外受精所用的精子在大、中型动物可采用人工按摩或电刺激法获得,小型动物需用手术法从附睾获得。卵子来源有两种方法,小型动物系采用超数排卵处理,从输卵管采集体内成熟卵子;或采用手术方法,从卵巢上采集未成熟卵子进行体外成熟。牛、羊等大、中型动物可进行活体采卵或从屠宰后动物的卵巢获得。 制约体外受精技术发展的主要因素有：在体外培养的卵母细胞的细胞质是否真正成熟不仅影响到受精，而且对卵裂及胚胎发育甚至着床和出生后也有较大影响，应在培养条件上进行研究；多精子受精难以控制，导致正常发育率低，可通过调整精子浓度或受精时间来控制；体外受精的胚胎在体外发育至一定阶段时会发生退行性变化，即发育阻滞(block)。 显微受精（microfertilization）技术是通过对动物配子进行显微操作以使其受精的技术。它是在体外受精的基础上，随着显微操作技术和设备的不断发展和完善而出现的。这一技术目前有透明带下注射、透明带钻孔、透明带部分切口和卵细胞质内注射等方法。 （四）胚胎培养 胚胎培养（embryo culture）是指在人工创造的类似于体内条件的环境中，对获取的早期胚胎进行体外培养，以便观察其发育或人工干预某一发育过程的技术。 目前胚胎培养一般有两种方法。一种是共培养系统，这种系统首先要求在培养皿上贴壁培养输卵管上皮细胞、颗粒细胞等，然后将受精卵和贴壁培养的上皮细胞一起培养，直至生产出可用胚胎。另一种是简单化学限定培养法。相对而言，简单化学限定培养法使用方便、培养液配制简单，而且成分明确便于研究特定物质对胚胎发育影响的特点，因此在早期胚胎体外培养中得到广泛使用。 （五）胚胎保存 胚胎保存（embryo preservation）是指应用超低温冷冻技术将胚胎保存起来而不丧失活力。1971年，whittingham首次报道冷冻小鼠胚胎获得成功。随后，对大鼠、兔胚胎的冷冻保存也取得了成功。到目前为止，已有十多种哺乳动物胚胎冷冻获得成功。超低温长期保存胚胎对生命科学的发展具有重要实际意义。 冷冻保存实验动物胚胎的方法有多种，主要有常规冷冻法、玻璃化冷冻法等。一般包括抗冻保护剂的添加、植冰和降温、胚胎解冻、抗冻保护剂的去除等步骤。 常规冷冻法是将经冷冻保护剂处理的胚胎以较慢速度（1℃/分钟）降温至-7℃，平衡10分钟后，在此温度诱发结晶，再平衡10分钟，以0.1—0.3℃/分钟的速度降温至-36℃以下，投入液氮中保存。按这种方法冻存的胚胎解冻时需要慢速升温。脱去冷冻保护剂的浓度方向与冷冻时相反，按相同浓度梯度，从高浓度向低浓度进行。 常规冷冻法的优点是细胞脱水完全，细胞内不易形成冰晶；缺