玉米愈伤组织分化的遗传分析及其相关基因克隆.pdf

摘 要 愈伤组织分化出完整植株是转基因受体的最终表现形式，从数量遗传学及基 因表达水平上进行研究，将获得愈伤组织分化的遗传信息，有利于拓宽玉米转基 因受体种质资源。 选出6个自交系配制完全双列杂交，分别对自交系和杂交组合进行幼胚培养，统 计绿苗分化数，对基因型差异、配合力效应、遗传模型和遗传效应等进行了研究。 本研究首次利用抑制性扣除杂交技术分离18599(红)愈伤组织分化相关基因。 将继代三次的胚性愈伤组织转入分化培养基中，分别在24h、48h、72h三个时间 段提取RNA，等量混合作为Tester样品池，取三个相应时段的分化前愈伤组织RNA， 等量混合作为Driver样品池，经两次扣除杂交和两次选择性扩增，构建差减cDNA Genbank序列比对，对愈伤组织分化相关的基因功能进行了讨论。对部分已知序列 设计引物进行RT-PCR扩增，探索基因差异表达丰度和表达时期。 取得了如下主要研究结果： 1．基因型是影响玉米自交系和杂交组合幼胚培养绿苗分化的重要因素，筛选 获得了最佳培养材料一-18599(红)，与其他己筛选获得的优良玉米组培材料相比， 不仅自身培养效率更高，作为亲本组配的后代也表现更好而且更稳定，是玉米转 基因受体系统研究获得的重大突破性材料，对它进行开发利用必将为加快我国玉 米基因工程育种的进程奠定良好的物质基础。 2．杂交后代绿苗分化数分布范围较广，表明玉米愈伤组织分化是数量遗传性 状，且高分化力可以通过杂交转移。因此，若要获得分化数较高的组合，至少选 用一个自身表现较高的亲本。而且控制分化的基因可能为核基因遗传，亲本杂交 方式对培养效率没有影响。 3．遗传模型分析的结果表明，基因加性效应与非加性效应比约为3：1，非加 性效应主要为显性效应，不存在上位性效应，但可能还存在基因连锁。经估算， 广义遗传力和狭义遗传力仅为41％和31％，因此，在对绿苗分化性状进行选择时， 应以利用杂种优势为主，可在早代进行选择。同时，对杂交亲本进行选择时，应 111 首先考虑反映非加性效应的特殊配合力，然后再考虑一般配合力。 率达80％，说明SSH结合差异表达基因筛选技术是研究愈伤组织分化过程中基因表 达的先进技术，可大大降低假阳性率。 5．分离获得了29个与愈伤组织分化相关的差异表达EST序列，经同源分析， 21个功能已知，7个功能未知，1个未发现同源序列，可能为新基因。己知功能的 克隆大多数来自在玉米、水稻和拟南芥生长发育中起重要作用的调控基因，包括 了蛋白质合成和降解酶7个、能量代谢相关酶1个、糖代谢相关酶6个，运输蛋 白1个、调节蛋白和酶3个，其它功能3个。 表达外，其它克隆在未分化和分化的愈伤组织中均有表达。除ZMECR27外，其它 10个克隆均被验证为阳性克隆。表达高峰期的检测表明，核酸合成相关基因同源 序列SNWI、酸性核糖体蛋白PO等在分化后24h达到表达高峰，蛋白质合成相关基 因同源序列蛋氨酸合成酶在48h内达到表达高峰，糖代谢相关基因同源序列甘油 醛一3一磷酸脱氢酶、果糖一l，6磷酸醛缩酶等在分化后三天内表达逐渐增强，无 法确定最终的表达高峰期。这说明愈伤组织分化是按照从核酸合成到蛋白质合成， 再到糖代谢及其它发育阶段的过程，这种有顺序、有规律的复杂代谢过程为满足 芽和根分化所需。 关键词：玉米；幼胚培养；分化；遗传模型；抑制性扣除杂交；差异表达基因 克隆 IV Abstract tobeawhole fromcallusisthefinalformal Regenerating plant for transformation Asit’sa genetic acceptors． representation traitcontroled isfavorabletodothe quantitative bymanygenes，it researchonQuantitativeGeneticsaswellason level．Then