应用噬菌体随机肽库技术的研究干扰素-α2b的模拟肽和拮抗肽.pdf

中文摘要 摘 要 干扰素(interferon，TFNl是一类重要的细胞因子，作为抗病毒和抗肿瘤的药 物己广泛用于临床。IFN通过与靶细胞表面的受体结合后，激活信号通路，诱导 相关抗病毒、抗肿瘤基因的转录和表达，发挥其生物学作用。而蛋白质之间的相 互作用或识别是通过局部肽段问的少量氨基酸残基相互作用来实现的，合理设计 的小肽可以完全或部分模拟完整蛋白分子的功能。通常完整的蛋白分子由于对蛋 白酶敏感、具有宿主免疫原性以及成本高等原因并不是最佳的候选药物。口FN除 了具有以上不足外，在临床使用时还会出现副作用，限制了其使用。而小分子胍 类细胞因子模拟物或拮抗剂由于其相对分子质量小、易于合成、无抗原性和毒副 作用较小等特点，在基础研究以及临床治疗等领域逐渐显现出其优势。本论文以 为靶标，利用噬菌体随机肽库技术，研究ⅢN．艘b的抗原表位、筛选TFN一皿b的 拮抗肽和模拟肽，对研究IFN的分子机制以及设计和开发Ⅱ州小分子模拟肽药 物有重要的意义。 本文旨先咀结合有Anti．Ⅱ州．出b多克隆抗体的免疫磁性微球为靶标，筛选 噬菌体随机12肽库。经ELIsA鉴定，旧轮筛选后同抗体结合的噬菌体得到明显 的宫集，其阳性率达到53％(49，92)。随机挑取12个阳性噬菌体进行序列分析 并与Ⅱ州．以b序列进行同源比对。结果显示：12个阳性克隆可分为三组，分别 对应IFN．以b 抗原性表位区，与ⅢN抗原预测分析的数据柏吻合。特异性抗体封闭试验和噬 菌体免疫试验表明，所得到的噬菌体展示肽在免疫反应性和免疫原性上均可蛆一 定程度地模拟Ⅱ州．02b不同的表位区。结合IFN的三维结构进行分析，三组模拟 表位均暴露在ⅡN分子结构的外部，更容易被抗原呈递细胞上的抗原识别受体 所识别。其中第二组表位AB环(29～35)直接参与与lFN受体的结合，推测在 使用IFN治疗疾病过程中，针对该区域所产生的中和抗体可能直接影响IFN的 生物学活性。 采用基因重组技术，本文成功构建了原核表达载体pET32a(+)／GFP-IFN blot 实验显示该融合蛋白GFP．ⅢN．02b保持了良好的Ⅱw抗原性；受体结合实验表 明，该融合蛋白能够与wIsII细胞上的ⅢN受体结合，并在488nm激发光F呈 现亮绿色荧光；抗病毒实验表明，该融合蛋白具有一定的抗病毒活性，比活力为 1．O×10 7IU，mg，证明该融合蛋白为具响绿色荧光和Ⅱ州抗病毒活性的双功能蛋 白。本研究为在细胞及分子水平研究伍N与靶细胞相互作用提供了简便、快捷、 直观的研究材料，同时也为IFN的代谢及功能研究建立r方法学基础。 以天然表达IFN受体的wIsH细胞并结合AnIi。ⅢN葩b多克隆抗体为靶分 子，本文采用竞争性洗脱的方法筛选噬菌体随机7肽库。经鉴定六轮筛选后同细 立摘要 胞和抗体结合的噬菌体得到明显的富集，最后一轮筛选的阳性率达到51．1％ (23／45)。随机挑取10个阳性克隆进行序列分析并与IFN序列进行同源比对。 E螺旋的148～158位氨基酸残基。分别选取对应AB环的第一组的No．26，以及 E螺旋篼三组的No．35两个噬菌体克隆为例做进一步研究。竞争性ELIsA和细 胞免疫组化实验显示，No26和No35能与IFN竞争性的同lFN受体或抗体结 细胞受体竞争实验显示，sP．7和FY_7能够有效地模拟IFN的部分受体结合表位， 特异性地抑制IFN与其受体的结合，其Ic50值分别为8．90腭和3．22 pg。采用细 胞病变抑制法分析sP．7和FY．7对ⅢN抗病毒活性的影响，结果显示当两个合成 肽的加入量在6．25～100耀之间时，合成肽对ⅡN抗病毒活性均具有抑制作用， 并且存在剂量依赖关系，其Ic50约为25 pg，证明sP．7和FY-7为两个ⅡN拮抗 肽。 为了得到具有抗病毒活性的mN模拟肽，本文在上述细胞筛选的基础上， 对上述同细胞结合的噬菌体，又增加了三轮功能筛选。经鉴定具有抗病毒活性的 噬菌体克隆得到了一定的富集，其阳性率为1．98％(20，1012)。随