眼镜蛇毒细胞毒素（CTX-b）的分离纯化、抗肿瘤作用及其机制研究.pdf

中文摘要 眼镜蛇毒细胞毒素(CTX-b)I拘分离纯化、抗肿瘤 作用及机制的研究 [背景与目的] 眼镜蛇毒细胞毒素(CTXs)来源丰富，抗肿瘤作用强，长期以来受到关 注，但作用机制仍不清楚。较长一段时间认为CTXs与细胞膜结合，依赖其 特征性的空间结构一“三指”插入细胞膜中形成孔道，可能影响细胞内外离 子的平衡，从而导致细胞肿胀、破裂。最近由不同研究室的学者在激光共聚 焦显微镜下分别观察到，CTX在数分钟内进入线粒体并破坏线粒体结构，以 及眼镜蛇毒CTX轻易进入活的肿瘤细胞内并浓集于溶酶体，其含量与CTX 的细胞毒作用密切相关。出此提示CTXs影响线粒体及溶酶体等胞内膜结构 的功能可能是其主要抗癌机制，对细胞膜的溶解作用可能是其下游作用。 目前认为线粒体是细胞凋亡调控的中心环节之一。线粒体感受多种刺激 发生线粒体渗透性转变孔(MPTP)开放，释放膜间隙中的促凋亡蛋白细胞 色素C和凋亡诱导因子AIF等。释放到细胞浆的细胞色素C在dATP存在的条件 蛋白水解级联作用引起细胞凋亡。 CTXs在数分钟内即进入细胞内与线粒体结合，那么对线粒体通路有何 影响?本研究从眼镜蛇毒中分离纯化不含PLA2的CTX．b，测定其体内外抗 细胞线粒体膜电位(A_Ilrm)、cytochrome 的活性变化的影响，从线粒体信号途径入手，探讨CTX—b的胞内作用机制。 C主要实验方法] 1 CTX．b的分离提纯 S-200Resolutin预装柱分离纯化。 HIigh 2 CTX．b的抗肿瘤活性 2．1 MTT法测定体外细胞毒作用 2．2对U14荷瘤小鼠瘤质量的影响 2．3形态学观察：荧光显微镜，电镜 2．4流式细胞仪DNA含量分析 3 CTX．b对线粒体功能的影响 3．1流式细胞仪测线粒体膜电位 3．2 3的变化 c及caspase9、caspase WeStem．blot测定胞浆cytochrome [结果] G．50柱层析得到4个峰，经小鼠毒性测定及分子 一、眼镜蛇粗毒经Sephadex S-200 HR预装柱 组分，其中组分Ⅵ经鉴定为CTX组分。将组分Ⅵ上Sephaeryl 不含PLA2。 在体内实验，CTX—b 率分别为22．5％及46．3％，具有显著性差异。体内外实验均显示TCTX．b强有 效的抗肿瘤作用。 三、首次研究CTX对人早幼粒自血病细胞--NB4细胞的促凋亡作用。荧光显 微镜、电镜下观察到，CTX．b(1．0 p．g／m1)作用于NB4细胞3h，即出现典型凋 亡改变：染色体凝集，核碎裂，凋亡小体形成等。流式细胞仪DNA含量分析， CTX—b出现明显的亚Gl期凋亡峰；作用6h， 作用3h，1．099／ml及1．59∥ml 三组剂量(CTX—b rtg／m1)均出现亚Gl期凋亡峰，并 O．59∥ml、1．09∥ml、1．5 与剂量成正相关。可见，致凋亡是CTX．b对NB4细胞的早期主要作用，且CTX．b 对NB4细胞的致凋亡作用具有剂量依赖及时间依赖关系。 四、首次证实CTX-b对NB4细胞线粒体信号通路的影响：CTX．b(1．0 I』g／m1) 作用0．5h，线粒体膜电位(A1Irm)已开始下降，在胞浆提取物中检测到 cytochrome c已由线粒体释放入胞浆，且△litm的下降与 c，显示c”ochrome 9酶 c的释放两者变化趋势相符。Westernb